酶在食品中的應(yīng)用PPT講稿

關(guān)于酶在食品中的應(yīng)用PPT講稿第1頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三

通過(guò)合理開(kāi)發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有效提高食品原料的深加工程度、改進(jìn)食品的加工工藝以及改善食品的風(fēng)味和品質(zhì)，從而達(dá)到提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。第2頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三

目前，酶技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域，如食品保鮮、制糖工業(yè)、釀造工業(yè)、、焙烤工業(yè)、乳制品工業(yè)、水果蔬菜加工、肉類及魚(yú)蝦類加工、蛋品加工、天然食品添加劑的生產(chǎn)以及改善食品的品質(zhì)和風(fēng)味等諸多方面。第3頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、在食品保鮮方面的應(yīng)用

食品在加工、運(yùn)輸和保鮮過(guò)程中，常易受到氧氣、微生物、溫度、濕度、光線等各種外界因素的影響，因使食品的色、香、味及營(yíng)養(yǎng)會(huì)發(fā)生變化，甚至導(dǎo)致食品敗壞，降低食品的食用價(jià)值。因此，食品保鮮已是食品加工、運(yùn)輸、保藏中的重要問(wèn)題，已引起食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。第4頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三

酶法保鮮技術(shù)就是利用酶的高效專一的催化作用，防止、降低或消除各種外界因素對(duì)食品產(chǎn)生的不良影響，進(jìn)而達(dá)到保持食品的優(yōu)良品質(zhì)和風(fēng)味特色，以及延長(zhǎng)食品保藏期的技術(shù)。第5頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三

目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、果酒、水果罐頭、脫水蔬菜、肉類及蝦米類食品、低酒度、香腸、糕點(diǎn)、飲料、干酪、水產(chǎn)品、啤酒、清酒、鮮奶、奶粉、奶油、生面條等各種食品的防腐保鮮，并取得了較大進(jìn)展。第6頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、在食品加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

大多數(shù)用途是在原料的加工與食品的生產(chǎn)。應(yīng)用領(lǐng)域主要包括：淀粉類食品、蛋白質(zhì)類食品、果蔬類食品、乳制品、飲料、天然食品添加劑等。第7頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用2、在蛋白質(zhì)制品的加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用4、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用5、在焙烤食品制造中的應(yīng)用6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用第8頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用淀粉類食品是含有大量淀粉或以淀粉為主要原料加工的食品。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等?；蚩梢陨晒咸菨{、環(huán)狀糊精（通過(guò)葡萄糖異構(gòu)酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等的作用）現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于糖果、冰淇淋、飲料、面包等的加工。第9頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、在蛋白質(zhì)制品的加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用蛋白質(zhì)食品是一種以蛋白質(zhì)為主要原料加工而成的食品。以天然的大分子蛋白存在的蛋白質(zhì)往往不具有生物活性或加工性能較差，而經(jīng)過(guò)某些蛋白酶的水解后往往能夠提高其生物活性或加工性能。目前較常用的是蛋白酶和乳糖酶。第10頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

在果蔬類食品的生產(chǎn)過(guò)程中，為了提高產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量，常常使用各種酶。水果蔬菜加工用酶中最常用的有果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶等。將酶制劑應(yīng)用于果蔬加工，主要有以下幾方面的作用。第11頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三果蔬本身所含有的果膠、纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等是引起果蔬汁渾濁、褐變等不良因素的主要原因，以傳統(tǒng)的壓榨和過(guò)濾等生產(chǎn)工藝難以使果蔬汁達(dá)到較高品質(zhì)，并且營(yíng)養(yǎng)成分大量損失。而酶技術(shù)的應(yīng)用，不僅克服了傳統(tǒng)加工工藝的缺點(diǎn)，且大幅度增加了果蔬汁的品質(zhì)。在提高果蔬出汁率方面應(yīng)用最廣泛的酶是果膠酶，其次是纖維素酶。此外在增香、除異味、提取果膠、真空或加壓滲酶法處理完整果蔬和提取蔬菜汁中酶的應(yīng)用也非常廣泛。第12頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三4、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用

1、啤酒工業(yè)中的應(yīng)用

啤酒以其特有的“麥芽的香味、細(xì)膩的泡沫、酒花的苦澀、透明的酒質(zhì)”為人們所喜愛(ài)。由于啤酒含有豐富的氨基酸和維生素,因此被稱為“液體面包”。制麥芽大麥含有全麥啤酒釀造用到的所有的酶,現(xiàn)在企業(yè)用到大量的谷物作為替代品,所以需要外源酶。而利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)與傳統(tǒng)啤酒釀造技術(shù)相結(jié)合,將提高啤酒質(zhì)量,降低生產(chǎn)成本,增加企業(yè)效益。酶在啤酒生產(chǎn)中的作用主要有輔料液化、提高發(fā)酵度降低雙乙酰、改善麥汁過(guò)濾、增加α-氨基酸、提高啤酒穩(wěn)定性、改善膜過(guò)濾速度、消除雜菌污染、啤酒除氧等。第13頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、白酒和黃酒工業(yè)中的應(yīng)用

白酒和黃酒產(chǎn)業(yè)是我國(guó)的一大傳統(tǒng)民族工業(yè),多年來(lái)為我國(guó)的國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出了較大貢獻(xiàn)。現(xiàn)代的白酒和黃酒的生產(chǎn),既要保持原酒的風(fēng)味特色,又要提高出酒率、簡(jiǎn)化操作,這就要求傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合。目前,酶在這兩種酒的生產(chǎn)應(yīng)用中已經(jīng)很廣泛。第14頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用的酶主要是糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶等,具有酶活力強(qiáng)、用量少、使用方便等優(yōu)點(diǎn),適量添加可提高出酒率和品質(zhì)。糖化酶、液化酶是白酒黃酒釀造中主要用酶,目前流行的生料釀酒和液化法黃酒釀造也主要是利用這兩種酶直接將淀粉液化糊化糖化來(lái)代替蒸煮作用的原理,而通過(guò)酶的固定化技術(shù)將它們固定在載體上,效果更好,也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。第15頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三5、在焙烤食品制造中的應(yīng)用

在一些國(guó)家對(duì)用化學(xué)劑改良法將作出立法限制，這就意味著更需要用酶法工藝來(lái)生產(chǎn)受歡迎的產(chǎn)品。用作焙烤食品面粉來(lái)源的小麥和其他谷物含有一些天然存在的酶,這些酶對(duì)于谷物的發(fā)芽和生長(zhǎng)是必需的。這些酶在焙烤工藝中亦十分重要,沒(méi)有它們,焙烤加工便不可能。這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。第16頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用

近年,

酶在乳品中的應(yīng)用已擴(kuò)展到更廣的領(lǐng)域?？偟膩?lái)說(shuō),當(dāng)前在乳制品生產(chǎn)中最常用、最重要的幾種酶為蛋白酶主要為凝乳酶、乳糖酶、乳過(guò)氧化物酶和脂肪酶等。酶在乳制品中最主要的應(yīng)用是蛋白酶的應(yīng)用,

特別是用凝乳酶加工干酪,

以及用乳糖酶將乳糖分解,

以提高有乳糖不耐癥的人對(duì)乳制品的消化力。乳過(guò)氧化物酶保鮮鮮奶和乳制品也已在國(guó)內(nèi)、國(guó)際得到了較廣泛的應(yīng)用。第17頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、在食品添加劑方面的應(yīng)用

食品添加劑是指用于改善食品品質(zhì)和風(fēng)味，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的少量化學(xué)合成或天然物質(zhì)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代食品行業(yè)中不可缺少的部分。第18頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三

按照食品添加劑的功能不同，可以分為酸味劑、抗結(jié)劑、抗氧化劑、漂白劑、膨松劑、著色劑、護(hù)色劑、酶制劑、增味劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、防腐劑、甜味劑、增稠劑、香味劑等二十余類。第19頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三

隨著酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，作為高效、安全的生物催化劑，酶已在食品添加劑的生產(chǎn)中得到較為廣泛的應(yīng)用。第20頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶

D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向異構(gòu),從而實(shí)現(xiàn)D-果糖向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶因其底物專一性的不同,被分為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(DTEase酶)和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPEase酶)兩類。第21頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、DTEase家族酶的微生物來(lái)源自1993年,日本學(xué)者第一次于PseudomonascichoriiST-24中發(fā)現(xiàn)一種可以催化己酮糖C-3位差向異構(gòu)化的酶,命名為D-己酮糖3-差向異構(gòu)酶。因其最適底物為D-塔格糖,后重新命名為DTEase酶。隨后,又發(fā)現(xiàn)另一種潛在的DTEase酶,該酶的最適底物為D-阿洛酮糖,可高效催化D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化,因此被命名為DPEase酶。與DTEase酶相比,DPEase酶對(duì)果糖的差向異構(gòu)活性更高,具有更高的應(yīng)用價(jià)值,所以近年來(lái)研究主要集中在DPEase酶上。第22頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、DTEase家族酶的酶學(xué)性質(zhì)微生物來(lái)源不同的DTEase家族酶具有不同的酶學(xué)性質(zhì)。雖然DTEase家族酶的氨基酸序列同源性不高(20%~62%),但DTEase家族酶都可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的相互轉(zhuǎn)化,其活性中心,金屬離子結(jié)合部位和底物結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸殘基高度保守。第23頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三

3、DTEase家族酶的蛋白質(zhì)工程來(lái)源于A.tumefaciens和C.cellulolyticum的DPEase酶及來(lái)源于P.cichorii的DTEase酶的晶體結(jié)構(gòu)被揭示。DTEase家族酶具有一個(gè)典型的TIM桶狀結(jié)構(gòu),由8個(gè)重復(fù)的β-折疊和α-螺旋單元構(gòu)成(β/α)8結(jié)構(gòu)。其中包含的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)表明金屬離子在催化時(shí)對(duì)于底物結(jié)合有重要的作用可穩(wěn)定差向異構(gòu)化過(guò)程中生成的烯二醇中間產(chǎn)物。第24頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三ClostridiumbolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程與食品級(jí)表達(dá)江南大學(xué)食品生物技術(shù)2014.6五、

第25頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三摘要糖尿病是一種世界性新興的疾病,嚴(yán)重威脅人類的健康。研究表明,單一糖類消耗成為糖尿病發(fā)病的主要因素之一。因此,利用低血糖應(yīng)答的甜味劑代替蔗糖成為預(yù)防糖尿病的有效方法。第26頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體,是一種己酮糖甜味劑,屬于稀有糖。D-阿洛酮糖的甜度為蔗糖的70%,但其能量?jī)H為蔗糖的0.3%,是食品中理想的代糖品。D-阿洛酮糖具有降低血糖、降低血脂、清除活性氧自由基和神經(jīng)保護(hù)等重要的生理功能。在食品加工過(guò)程中,可改善凝膠特性并可產(chǎn)生良好的風(fēng)味。第27頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三D-阿洛酮糖在天然產(chǎn)品中存在較少,但生物催化新技術(shù)的開(kāi)發(fā)使D-阿洛酮糖的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。第28頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三本研究前期利用鮑氏梭菌(Clostridiumbolteae)ATCCBAA-613進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng),確定該菌株具有催化D-果糖差向異構(gòu)生成D-阿洛酮糖的能力,無(wú)副產(chǎn)物產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上,對(duì)該鮑氏梭菌(C.bolteae)ATCCBAA-613全基因組中預(yù)測(cè)的DPEase酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá);對(duì)DPEase酶進(jìn)行分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、構(gòu)效關(guān)系及分子改造等方面進(jìn)行研究;實(shí)現(xiàn)DPEase酶在食品級(jí)宿主枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis中表達(dá),并分別基于Cre/lox系統(tǒng)和反向篩選標(biāo)記mazF基因,成功構(gòu)建食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。第29頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)（1）、

C.bolteaeDTEase酶基因的擴(kuò)增（2）、PCR產(chǎn)物的克隆（3）、C.bolteaeDTEase酶基因的測(cè)序及序列分析（4）、D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建（5）、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化（6）、重組E.coli細(xì)胞催化D-果糖差向異構(gòu)化反應(yīng)（7）、D-阿洛酮糖的鑒定第30頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三第31頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三證明基因CLOBOL_00069所翻譯的假定蛋白,其關(guān)鍵序列與DTEase家族酶有很高的同源性,具有相同的保守序列,因此,EDP19602可能是一種DTEase家族酶。第32頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-22b(+)分別用NdeI和XhoI酶切后,回收酶切產(chǎn)物的目的條帶純化后進(jìn)行連接,其構(gòu)建過(guò)程如圖2-8所示。載體pET-22b(+)帶有C末端His-Tag序列,利用pET-22b(+)表達(dá)的重組蛋白帶有6個(gè)His標(biāo)記,可利用Ni2+-ChelatingFaseFlow親和色譜柱進(jìn)行純化。第33頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三第34頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分離、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究（1）、Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析（2）、Superdex200(10/300GL)凝膠層析純化結(jié)果（3）、Superdex200凝膠色譜確定C.bolteaeDPEase酶的分子量（4）、金屬離子對(duì)C.bolteaeDPEase酶酶活的影響（5）、C.bolteaeDPEase酶的最適pH及pH穩(wěn)定性（6）、C.bolteaeDPEase酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性（7）、C.bolteaeDPEase酶的底物特異性及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究（8）、C.bolteaeDPEase酶的平衡率第35頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三C.bolteaeDTEase酶亞基分子量約為34kDa,比預(yù)測(cè)的分子量33kDa大約1kDa,可能是由于在其C端增加6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。經(jīng)過(guò)Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析柱純化后,即可獲得較純的目的蛋白。計(jì)算得到目的蛋白分子量約為139kDa,說(shuō)明該DTEase酶可能是四聚體。此結(jié)果與來(lái)源于A.Tumefaciens和C.cellulolyticum等DTEase家族酶中的DPEase酶一致。第36頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三該酶的最適反應(yīng)pH為7.0。中性環(huán)境下,酶活損失較低,在pH6.0~7.5的緩沖液中保持2h后,殘余酶活可在90%以上;而在偏酸或偏堿性環(huán)境下,其酶活損失較大。酶的在55℃的酶活最高當(dāng)溫度<55℃時(shí),酶活力隨溫度的升高而升高,當(dāng)溫度>60℃后,酶活力隨溫度升高而顯著下降第37頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三3、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的催化機(jī)理初探及分子改造（1）、

C.bolteaeDPEase的結(jié)構(gòu)分析及活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)（2）、

改造位點(diǎn)的確定（3）、

Ala掃描定點(diǎn)突變（4）、催化活性中心關(guān)鍵氨基酸Glu152和Glu246的定點(diǎn)突變（5）、底物結(jié)合關(guān)鍵氨基酸Glu158,His188和Arg217的定點(diǎn)突變（6）、底物識(shí)別關(guān)鍵氨基酸Tyr68和Gly109的定點(diǎn)突變（7）、Y68和G109位突變體酶的酶學(xué)性質(zhì)（8）、雙突變體酶Y68I/G109P的酶學(xué)性質(zhì)研究第38頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三4、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)（1）、

C.bolteaeDPEase酶基因克隆（2）、

B.subtilis重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定（3）、B.subtilis重組菌的表達(dá)及活性鑒定（4）、重組C.bolteaeDPEase酶的分離純化（5）、重組

C.bolteaeDPEase酶的酶學(xué)性質(zhì)第39頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三5、基于Cre/lox系統(tǒng)的C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的食品級(jí)表達(dá)（1）、重疊PCR（2）、pP43DPE載體的克?。?）、表達(dá)載體pDGI-7S6的構(gòu)建（4）、表達(dá)載體pDGI-7S6-DPE的構(gòu)建（5）、重組菌B.Subtilis/7S6-DPE的構(gòu)建及篩選（6）、重組菌B.subtilis/lox-DPE,pTSC的構(gòu)建及篩選（7）、重組菌B.subtilis/lox-DPE的構(gòu)建及篩（8）、重組菌B.subtilis/lox-DPE的發(fā)酵曲線第40頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三6、基于mazF反向篩選標(biāo)記的C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的食品級(jí)表達(dá)（1）、表達(dá)載體pDGI-DPE的構(gòu)建（2）、重組菌

B.subtilis/REF的構(gòu)建及篩選（3）、重組菌B.subtilis/DPE的構(gòu)建及篩選（4）、重組菌B.subtilis/DPE的發(fā)酵曲線第41頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三7、結(jié)論1、利用PCR的方法擴(kuò)增獲得C.bolteaeATCCBAA-613的DPEase的基因序列,利用pET-22b(+)表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主Escherichia.coliBL21(DE3),成功構(gòu)建重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。2.對(duì)重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期OD值為1.0左右后,加入終濃度為5g/L的乳糖,20℃

條件下誘導(dǎo)7h,可達(dá)到最大酶活,為6.1U/mL發(fā)酵液。利用重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069全細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。經(jīng)鑒定,產(chǎn)物為D-阿洛酮糖,說(shuō)明C.bolteaeATCCBAA-613的DPEase基因在E.coliBL21中表達(dá)正確并具有轉(zhuǎn)化D-果糖為D-阿洛酮糖的能力。第42頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.利用Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析柱和Superdex20010/300GL凝膠柱對(duì)C.bolteaeDPEase酶進(jìn)行分離純化,其亞基分子量約為34kDa,酶蛋白分子量為139kDa,證實(shí)來(lái)源于C.bolteae的DPEase酶為四聚體酶。C.bolteaeDPEase酶是金屬蛋白酶,Mn2+和Co2+可顯著增強(qiáng)酶活。當(dāng)Co2+濃度為0.4mmol/L時(shí),C.bolteaeDPEase酶獲得最大酶活。4.C.bolteaeDPEase酶的最適反應(yīng)pH為7.0,在pH6.5~7.5之間其相對(duì)酶活較高,表現(xiàn)出良好的活性。最適反應(yīng)溫度為55℃,在45℃以下,該酶較穩(wěn)定,當(dāng)溫度大于50℃時(shí),酶的熱穩(wěn)定性較差。在Co2+存在的情況下,酶的熱穩(wěn)定性顯著提高。55℃

時(shí),Co2+的添加可使酶的半衰期延長(zhǎng)至原來(lái)的3.6倍。第43頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三5.研究C.bolteaeDPEase酶的底物特異性,發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)D-阿洛酮糖的底物特異性最高,D-果糖次之,其次為D-塔格糖,而對(duì)磷酸化的糖基本沒(méi)有作用。并測(cè)定該酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù),當(dāng)以D-阿洛酮糖作為底物時(shí),其Km、kcat和kcat/Km分別為27.4mM、2935min-1和107.1min-1mM-1。該酶對(duì)D-阿洛酮糖的Km值遠(yuǎn)小于其他底物,催化效率kcat/Km較其他底物更大,其說(shuō)明其對(duì)D-阿洛酮糖的親和性更高,其最適底物是D-阿洛酮糖。因此該酶被鑒定為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。第44頁(yè)，講稿共50頁(yè)，2023年5月2日，星期三6.利用已有的晶體結(jié)構(gòu)信息,利用SWISS-MODEL對(duì)C.bolteaeDPEase酶單體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬,利用Discoverystudio軟件對(duì)C.bolteaeDPEase酶和D-果糖進(jìn)行對(duì)接,獲得位于活性中心的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)為Glu158,His188,Arg217,Glu152,Glu246,Y68和G109。突變結(jié)果表明,Glu152和Glu246為催化活性中心關(guān)鍵氨基酸,Glu158,His188和Arg217與底物結(jié)合有關(guān),68和109