臨床醫(yī)學檢驗臨床免疫學與檢驗

臨床醫(yī)學檢驗臨床免疫學與檢驗第1頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第一章概述免疫應答的過程1、識別階段：巨噬細胞等抗原遞呈細胞對外來抗原或自身變性抗原

進行識別、攝取、降解和遞呈抗原信息給T輔助細胞

（Thc）及相關淋巴細胞的過程。2、活化階段：B細胞接受抗原刺激后活化、增殖、分化為漿細胞；T細胞在接受抗原刺激和協(xié)同刺激雙信號后活化、增殖、

分化為效應細胞。3、效應階段：漿細胞分泌特異性抗體，執(zhí)行體液免疫功能；T細胞中

的Th細胞分泌細胞因子等效應分子，T殺傷細胞執(zhí)行細

胞毒效應功能。@吉普塞舞神第2頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第一章概述免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞、免疫分子組成。（一）中樞免疫器官1、骨髓：造血干細胞（HSC）分化、發(fā)育、成熟2、胸腺：T細胞發(fā)育的重要中樞器官（二）外周免疫器官及組織1、淋巴結2、脾：最大的外周淋巴器官3、粘膜伴隨的淋巴組織：如扁桃體、小腸的派氏集合淋巴結、闌尾淋巴細胞再循環(huán)與歸巢淋巴細胞在體內依靠歸巢受體由定居地經淋巴循環(huán)及血液循環(huán)不斷往返于外周免疫器官、二級淋巴組織及全身器官組織、淋巴循環(huán)匯集于胸導管，經上腔靜脈進入血液循環(huán)。血液循環(huán)中的淋巴細胞及各類免疫細胞在毛細血管后微靜脈處穿越高壁內皮細胞，進入淋巴組織及淋巴器官，再次進入淋巴循環(huán)。@吉普塞舞神第3頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第一章概述免疫細胞（一）淋巴細胞1、T細胞：胸腺依賴淋巴細胞；約占淋巴細胞的70%~75%。①T細胞受體（TCR）：又稱T細胞抗原受體，是T細胞特有的表面標志。T細胞識別抗原和轉導信號是由TCR特異識別MHC分子遞呈的抗原肽，CD3分子轉導T細胞活化的第一信號。

②簇分化抗原（CD）：T細胞發(fā)育不同階段的亞群存在不同的分化抗原，這是區(qū)分T淋巴細胞的重要標志。2、B細胞：骨髓依賴性淋巴細胞，約占淋巴細胞的5%~25%。主要功能：產生抗體、遞呈抗原、分泌細胞因子參與免疫調節(jié)。B細胞受抗原刺激后可分化為產生抗體的漿細胞和長壽記憶細胞。3、自然殺傷細胞（NK）NK細胞無需抗原刺激，可非特異直接殺傷腫瘤和病毒感染的細胞，因此在免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中起重要作用?；罨疦K細胞可分泌IFNγ和TNFα等細胞因子，參與免疫調節(jié)作用。@吉普塞舞神第4頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第一章概述免疫細胞（二）免疫輔助細胞1、單核-巨噬細胞系統(tǒng)共同特點是表達MHCⅡ類分子及具有吞噬作用。2、樹突狀細胞專職抗原遞呈細胞@吉普塞舞神第5頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第一章概述免疫分子（一）免疫球蛋白分泌型（sIg）：主要存在于體液中，具有抗體的各種功能。膜型（mIg）：表達于B細胞表面，稱為膜表面免疫球蛋白，為抗原

受體?；瘜W結構：2條重鏈（H）和2條輕鏈（L）以二硫鍵連接在一起。V-可變區(qū)；C-恒定區(qū)按照體內含量的多少分為：IgG、IgA、IgM、IgD、IgEIg的輕鏈分為κ鏈和λ鏈，一個天然Ig分子的兩條輕鏈相同。@吉普塞舞神第6頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第一章概述免疫分子（一）免疫球蛋白1、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白，是再次應答的主要抗體，

也是唯一能通過胎盤的抗體。大多數抗菌抗體、抗病毒抗

體都是IgG，某些自身抗體及超敏Ⅱ型抗體也是IgG，免疫

檢測中第二抗體也以IgG為主。2、IgA：大部分血清型Ig為單體；分泌型sIgA為二聚體。每一個sIgA

分子含一個J鏈和一個分泌片。sIgA性能穩(wěn)定，主要存在于

胃腸道、支氣管分泌液、初乳、唾液、淚液中，是參與黏

膜局部免疫的主要抗體。3、IgM：五聚體，Ig分子中最大的，主要存在于血液。是個體發(fā)育

最早合成的抗體，也是抗原刺激后最先產生的抗體。感

染過程中IgM水平升高，說明近期感染；新生兒臍血中若IgM增高，說明有宮內感染。4、IgD：作用不明，B細胞膜上的IgD可作為B細胞分化成熟的標志。5、IgE：單體結構，血清中最少。親細胞抗體，介導Ⅰ型超敏反應，

在特異性過敏反應和寄生蟲早期感染患者血清中可升高。@吉普塞舞神第7頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第一章概述免疫分子（二）補體系統(tǒng)補體是存在于人和脊椎動物正常新鮮血清及組織液中的一組具有酶樣活性的球蛋白。補體的大多數組分都是糖蛋白，多屬于β球蛋白。含量最高的補體：C3、C4含量最低的補體：C2補體性質不穩(wěn)定，加熱56℃、30min可使血清中絕大部分補體組分喪失活性，稱為滅活。補體的激活途徑：1、經典途徑：以結合抗原后的IgG或IgM類抗體為主要激活劑，補體C1~C9共11種成分全部參與了激活途徑。2、替代途徑：又稱旁路途徑。病原微生物等細胞壁成分提供接觸面

直接激活補體C3，然后完成C5~C9的激活過程。激活

物主要是細胞壁成分。3、MBL途徑：由急性炎癥期產生的甘露糖結合凝集素（MBL）與病

原體結合后啟動激活。補體既可參與機體的防御效應和自身穩(wěn)定，亦可引起免疫損傷。@吉普塞舞神第8頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第一章概述免疫分子（三）細胞因子免疫細胞分泌的多肽或小分子蛋白質。通過自分泌、旁分泌、內分泌的方式發(fā)揮作用。按生物學功能分：白細胞介素、干擾素、生長因子、趨化因子家族、

腫瘤壞死因子、集落刺激因子。細胞因子受體分：免疫球蛋白基因超家族、I型細胞因子受體家族、Ⅱ型細胞因子受體家族、Ⅲ型細胞因子受體家族、

趨化性細胞因子受體家族。（四）黏附分子黏附分子（CAM）是介導細胞間或細胞與細胞外基質間相互結合和黏附作用的小分子多肽或糖蛋白。以受體-配體的結合形式發(fā)揮作用。參與機體免疫應答、炎癥發(fā)生、凝血、創(chuàng)傷愈合和腫瘤轉移等病理生理過程。（五）CD抗原人類白細胞分化抗原（HLA）是指血細胞在分化成熟及活化過程中，出現或消失的細胞表面標記分子。@吉普塞舞神第9頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二章抗原抗體反應一、抗原抗體反應的原理抗原抗體是一種非共價結合、不形成共價鍵。1、靜電引力；2、范德華力；3、氫鍵結合力；4、疏水作用力：是這些結合力中最強的。親和性：是指抗體分子上一個抗原結合點與對應的抗原表位之間相

適應而存在的引力，它是抗原抗體間固有的引力。親和性用平衡常數K來表示，K值越大，親和性越強，結合越牢固?？贵w是球蛋白，溶解在水中為膠體溶液，不會發(fā)生自然沉淀。@吉普塞舞神第10頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二章抗原抗體反應二、抗原抗體反應的特點1、特異性；2、可逆性：親和層析法就是利用這個原理來純化抗原或抗體。3、比例性：只有當抗原抗體分子比例合適時充分結合，沉淀物形

成快而多，稱為抗原抗體反應的等價帶；

若抗原或抗體極度過剩則無沉淀形成，稱為帶現象，

抗體過量時，稱為前帶，抗原過量時，稱為后帶。4、階段性：第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結合的階段，反應快；

第二階段為可見反應階段，反應慢。@吉普塞舞神第11頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二章抗原抗體反應三、影響抗原抗體反應的因素

抗體的濃度、特異性和親和性都影響抗原抗體的反應。等價帶的寬窄也影響抗原抗體復合物的形成，單克隆抗體不適于沉淀反應。顆粒性抗原出現凝集反應；可溶性抗原出現沉淀反應；單價抗原與相應抗體結合不出現沉淀反應。環(huán)境因素1、電解質：抗原抗體發(fā)生特異性結合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體，

此過程需要電解質參加，常用0.85%NaCl。2、酸堿度：一般在pH6~9之間。3、溫度：一般以15℃~40℃為宜。@吉普塞舞神第12頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章免疫原和抗血清的制備免疫原：指能誘導機體產生抗體或致敏淋巴細胞，并能在體內外與

抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應的物質。一、顆粒型抗原的制備各種細胞、細菌、寄生蟲等皆為顆粒型抗原1、細胞抗原（如綿陽紅細胞）一般情況下經生理鹽水或其他溶液洗凈，配置一定濃度即可。2、細菌抗原多用液體或固體培養(yǎng)基，經集菌后處理。顆粒性抗原大多用靜脈內注射免疫法。二、可溶性抗原的制備與純化蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、酶、補體、細菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等。胃蛋白酶或胰酶處理，可獲得游離的單個細胞。溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶等使細菌或組織裂解。木瓜酶將IgG裂解成2個Fab片段和1個Fc片段；胃蛋白酶可將IgG裂解成F（ab，）2片段及數個小片段；胰蛋白酶可將IgG切成不規(guī)則的肽鏈。@吉普塞舞神第13頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章免疫原和抗血清的制備三、半抗原性免疫原的制備半抗原：某物質在獨立存在時只具有抗原性而無免疫原性。半抗原與蛋白質載體或高分子聚合物結合后才有免疫原性。載體1、蛋白質類：以牛血白蛋白最常用。2、多肽聚合物：常用多聚賴氨酸。3、大分子聚合物和某些顆粒。半抗原性免疫原的鑒定一般認為至少要20個以上的半抗原分子連接到一個載體分子上，才能有效刺激免疫動物產生抗體。因此，在半抗原與載體連接后，應測定半抗原與載體的比例。1、吸收光譜分析法2、放射性核素標記半抗原滲入法@吉普塞舞神第14頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章免疫原和抗血清的制備免疫佐劑佐劑的種類1、化合物，如弗氏不完全佐劑2、生物制劑，①經處理改造的細菌及代謝產物，如卡介苗；

②細胞因子及熱休克蛋白等。弗氏佐劑分為弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑弗氏完全佐劑=弗氏不完全佐劑+卡介苗使用時加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原與佐劑形成油包水乳劑。佐劑和抗原的比例為1:1。佐劑的作用1、改變抗原的物理性狀、延緩抗原降解和排除，從而更有效地刺激免疫系統(tǒng)；2、刺激單核-吞噬細胞系統(tǒng)，增強其處理和遞呈抗原的能力；3、刺激淋巴細胞增殖和分化；4、致變抗體的產生類型和誘導遲發(fā)型超敏反應。@吉普塞舞神第15頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章免疫原和抗血清的制備抗血清的制備含有抗體的血清即抗血清?？乖瓉碓磁c動物種屬差異越大，免疫原性越強，免疫效果越好。R型抗血清：用家兔及其他動物免疫產生的抗體，抗原抗體反應比

例合適范圍較寬，適于作為診斷試劑。H型抗血清：用馬等大型動物免疫產生的抗體，抗原抗體反應比例

合適范圍較窄，一般作為免疫治療。某些動物體內有類似物質時，蛋白質抗原對這些動物免疫原性極差。如：IgE對綿羊；胰島素對家兔；多種酶類對山羊。@吉普塞舞神第16頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫程序1、免疫原的劑量：

劑量過大或過小都有可能產生免疫耐受，在一定劑量范圍內，免疫原劑量越大，產生的抗體效價越高。2、免疫途徑：

皮內、皮下、肌內、靜脈、腹腔、淋巴結等途徑。皮內或皮下免疫時一般采用多點注射。初次免疫一般選擇皮內接種，加強免疫和顆粒性抗原一般選擇靜脈注射。寶貴抗原可選擇淋巴結內微量注射。3、免疫間隔時間第1次與第2次免疫間隔時間以10~20天為好，第3次及以后的間隔一般為7~10天。采血法1、頸動脈采血法2、心臟采血法3、靜脈采血法第三章免疫原和抗血清的制備@吉普塞舞神第17頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章免疫原和抗血清的制備抗血清的鑒定1、抗體特異性的鑒定常用雙向免疫擴散法，觀察沉淀線。2、抗體效價的測定顆粒型抗原-凝集試驗可溶性抗原-雙向免疫擴散試驗、ELISA等稀釋方法：①將經過系列稀釋的血清分別與一個濃度的抗原反應；②同時稀釋抗原和抗血清，分別與不同濃度的抗血清進行雙向免

疫擴散實驗（棋盤滴定）3、抗體純度的鑒定SDS、雙向免疫擴散試驗、免疫電泳等抗血清的保存①短期保存：2~8℃；②冷凍：-80~-20℃，分為小包裝，一般保存5年，避免反復凍融。③真空干燥：5~10年@吉普塞舞神第18頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章免疫原和抗血清的制備抗血清的純化IgG類抗體的純化方法有鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法。雜質的去除：1、親和層析法2、吸附劑法@吉普塞舞神第19頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第四章單克隆抗體與基因工程抗體的制備雜交瘤技術：利用聚乙二醇（PEG）為細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細胞與具有體外生長繁殖能力的小鼠骨髓瘤細胞融為一體。這種雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔積液中即可得到高效價的單克隆抗體。小鼠骨髓瘤細胞：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉化酶（HGPRT）或胸腺

嘧啶激酶（TK）的缺陷株腫瘤細胞合成DNA一般有兩條途徑：一條是生物合成的主要途徑，利用糖和氨基酸合成核苷酸進而合成DNA，葉酸拮抗物（甲氨蝶呤）可阻斷該途徑；另一條是替代途徑，當葉酸代謝受阻時，細胞通過HGPRT和TK利用核苷酸的前體合成核苷酸，進而合成DNA。因此篩選雜交瘤細胞用HAT培養(yǎng)液。HAT培養(yǎng)液：在基礎細胞培養(yǎng)液內添加次黃嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。細胞的選擇：有限稀釋法、顯微操作法、熒光激活細胞分選儀、軟瓊脂平板法。@吉普塞舞神第20頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第四章單克隆抗體與基因工程抗體的制備單克隆抗體的特性：1、高度特異性2、高度的均一性和可重復性3、弱凝集反應和不呈現沉淀反應4、對環(huán)境敏感性局限性：單克隆抗體反應強度不如多克隆抗體基因工程抗體1、人源化抗體：減少抗體異源性，利于臨床應用。嵌合抗體：從雜交瘤細胞里分離出可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)的基

因連接，表達鼠-人嵌合抗體。改型抗體：將人抗體可變區(qū)（V）中互補決定簇（CDR）序列改成鼠

源單抗CDR序列。2、小分子抗體：可在大腸桿菌等原核細胞內表達。3、抗體融合蛋白：指利用基因工程技術將抗體片段與其他生物活

性蛋白融合得到的產物。4、雙特異性抗體：兩個抗原結合位點具有不同的特異性。5、噬菌體抗體庫技術：可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒

感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性。@吉普塞舞神第21頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第五章凝集反應凝集反應是一個定性或半定量的檢測方法，將抗體做一系列稀釋，與抗原結合產生凝集的最高稀釋倍數作為其效價或滴度。兩個階段：①抗原抗體特異性結合；②出現可見的顆粒聚集。直接凝集反應原理：細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原，在適當的電解質參與下可直接與相應抗體結合出現凝集?？乖贵w—凝集素1、玻片凝集試驗：定性分析，一般用來鑒定菌種和ABO血型測定。2、試管凝集試驗：半定量，用定量抗原懸液與一系列梯度倍比稀釋的待檢血清混合，保溫靜置后，根據每管內顆粒凝集的程度，判斷待檢血清中有無相應抗體及效價。如肥達試驗—診斷傷寒、副傷寒；

外斐試驗—診斷立克次體；

輸血時的交叉配血試驗。@吉普塞舞神第22頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第五章凝集反應間接凝集反應

是將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小的顆粒性載體表面，然后與相應抗體（或抗原）作用，在適宜電解質存在的條件下，出現特異性凝集現象。間接凝集反應的類型1、正向間接凝集反應：可溶性抗原致敏載體，用以檢測標本中待測抗體的凝集反應。2、反向間接凝集反應：特異性抗體致敏載體，用以檢測標本中待測抗原的凝集反應。3、間接凝集抑制試驗：先將可溶性抗原（或抗體）與相應抗體（或抗原）試劑混合，然后再加入抗原（抗體）致敏的載體顆粒，則能抑制原先的凝集現象，稱為正向（或反向）間接凝集抑制試驗。4、協(xié)同凝集反應：用金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）做載體，它能夠與IgG的Fc段結合，稱為抗體致敏的顆粒載體。如與相應抗原接觸，即出現反向間接血凝抑制試驗?？捎糜诩毦⒉《镜闹苯訖z測。間接血凝抑制試驗載體常用紅細胞、膠乳顆粒及明膠顆粒@吉普塞舞神第23頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第五章凝集反應明膠凝集試驗：血清中含有病毒抗體則呈肉眼可見的粉紅色凝集。廣泛用于HIV-1抗體和抗精子抗體等的檢測。自身紅細胞凝集試驗抗人O型紅細胞的單克隆抗體能與任何型紅細胞結合，但不引起凝集反應，這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體，可用于檢測標本中的抗原。反應中的紅細胞是未經致敏的受檢者新鮮紅細胞，因此反應中的標本為受檢者的全血?？捎糜贖IV抗體，HBsAg的檢測?？骨虻鞍自囼炗址QCoombs試驗，是檢測抗紅細胞不完全抗體的一種有效方法。包括直接C試驗和間接C試驗，分別檢測紅細胞上的不完全抗體和游離在血清中的不完全抗體。廣泛應用于血液病的檢測，如自身免疫性溶血性貧血、藥物誘導的貧血、新生兒溶血癥等，還可采用專一特異性的抗球蛋白的血清，如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗補體血清等，分析結合于紅細胞上的不完全抗體的免疫球蛋白亞類。@吉普塞舞神第24頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第六章沉淀反應沉淀反應：指可溶性抗原與相應抗體在特定條件下發(fā)生特異性結合時

出現的沉淀現象。沉淀反應的抗原多為蛋白質、多糖、血清、毒素等可溶性物質。第一階段：抗原抗體發(fā)生特異性結合，肉眼不可見，時間短。第二階段：形成可見的免疫復合物，如沉淀線、沉淀環(huán)，

約需幾十分鐘到數小時。@吉普塞舞神第25頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月液體內沉淀實驗抗原抗體溶液在電解質的存在下結合，形成絮狀沉淀物，這種絮狀沉淀受抗原抗體比例的直接影響，因此常用來作為測定抗原抗體反應最適比例的方法。1、抗原稀釋法；2、抗體稀釋法；3、方陣滴定法（棋盤滴定法）。免疫濁度測定本質上屬于液體內沉淀反應，可進行液體中微量抗原、抗體及小分子半抗原定量檢測?？乖^量：形成IC（免疫復合物）分子小，且會發(fā)生再解離，濁

度下降，這叫做高劑量鉤狀效應?？贵w過量：IC的形成隨著抗原的增加而增加，抗原抗體最適比例

處達到高峰，這就是經典的海德堡曲線理論。免疫比濁法的基本原理就是在反應體系中保持抗體適當過量?？贵w的選擇：特異性強、效價高、親和力強，使用R型抗體。pH6.5~8.5使用磷酸鹽緩沖液做反應液增濁劑：聚乙二醇（PEG）、吐溫-20第六章沉淀反應@吉普塞舞神第26頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠內沉淀試驗利用可溶性抗原和相應抗體在凝膠內擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度比例恰當的位置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。凝膠支持物：瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠等。1、單向擴散試驗在瓊脂內混入抗體，待測抗原從局部向瓊脂內自由擴散，如抗原和相應抗體結合，形成沉淀環(huán)。Mancini曲線（M曲線）：適用大分子抗原和長時間擴散（＞48h）結

果，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關系。Fahey（F曲線）：適用于小分子抗原和較短時間（24h）擴散的結果，

用半對數紙畫線，濃度對數與擴散環(huán)直徑呈線性關系。雙環(huán)現象：出現兩種抗原性相同成分。第六章沉淀反應@吉普塞舞神第27頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠內沉淀試驗2、雙向擴散試驗讓抗原和抗體雙方都在瓊脂中各自向對方擴散，在比例恰當處形成抗原抗體沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關系，可對抗原或抗體進行定性分析。平板法是最常用的方法。①抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計：②抗原抗體相對分子量的估計：擴散慢者圈子小，局部濃度大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方，如果分子量大致相等，則呈直線。③抗原性質的分析：兩條沉淀線相互吻合，說明抗體和兩個抗原的相同表位結合而沉淀，兩個抗原相同；沉淀線呈部分相切，說明兩個抗原之間有部分相同；兩條沉淀線交叉而過，說明兩個抗原完全不同。④抗體效價的滴定：出現沉淀線最高的抗體稀釋度為該抗體效價。⑤抗原或抗體純度鑒定：多條沉淀線說明抗體不純。第六章沉淀反應@吉普塞舞神第28頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫電泳技術1、對流免疫電泳實質是將雙向免疫擴散與電泳相結合的定向加速的免疫擴散技術。抗原帶負電荷向正極移動；抗體在電滲作用下隨水流向負極。2、火箭免疫電泳實質是加速的單向擴散試驗。3、免疫電泳是區(qū)帶電泳與免疫雙擴散相結合的免疫分析技術?？乖涬娪痉謪^(qū)帶，沿電泳方向挖一平行抗體槽，加入相應抗血清做雙向擴散，形成弧形沉淀線。

多發(fā)性骨髓瘤患者血清在免疫電泳后，可觀察到異常的M蛋白沉淀弧。4、免疫固定電泳電泳加沉淀反應技術，可用于各種蛋白質鑒定。先將待測樣品做區(qū)帶電泳，覆蓋抗血清，形成抗原抗體復合物而沉淀。分辨率強，敏感性高，操作周期短，結果易于分析，目前作為常規(guī)檢測。5、交叉免疫電泳將區(qū)帶電泳和火箭免疫電泳相結合，可一次同時對多種抗原定量。第六章沉淀反應@吉普塞舞神第29頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第七章放射免疫分析放射免疫分析（RIA）是以放射性核素標記的抗原與反應系統(tǒng)中未標記抗原競爭結合特異性抗體為基本原理來測定待檢樣品中抗原量的一種分析方法。免疫放射分析（IRMA）是用放射性核素標記的過量抗體與待測抗原直接結合，采用固相免疫吸附載體分離結合與游離標記抗體的非競爭放射免疫分析法。常用的放射性核素：125I、131I、3H、14C放射性碘原子通過取代反應置換被標記物分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子。比較：IRMA反應速率、特異性、靈敏度和檢測范圍都較RIA高。應用：常用于各種激素、微量蛋白質、腫瘤標志物和藥物等測定。@吉普塞舞神第30頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第八章熒光免疫技術常用熒光色素：1、異硫氰酸熒光素（FITC）：黃綠色熒光，最常用；2、四乙基羅丹明（RB200）：橘紅色熒光；3、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）：橙紅色熒光；4、藻紅蛋白（R-RE）：橙色熒光。其他熒光物質：某些3價稀土鑭系元素，其中銪（Eu3+）應用最廣，其熒光衰變時間長，最適合用于時間分辨熒光免疫測定。時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）：是一種非放射性核素免疫分析技術，用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效排除非特異性熒光的干擾，極大提高了分析靈敏度。熒光偏振免疫測定：利用抗原抗體競爭反應原理，根據熒光素標記抗原與其抗原抗體復合物的熒光偏振程度的差異，測定體液中小分子物質的含量。常用FITC標記小分子抗原。@吉普塞舞神第31頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第八章熒光免疫技術熒光酶免疫測定：利用酶標記抗原或抗體，與待檢物反應，借助酶反應熒光底物，經酶促反應生成穩(wěn)定且高效的熒光物質，通過測定熒光強度確定待檢抗原或抗體的含量。常用堿性磷酸酶ALP標記。熒光免疫技術的應用1、自身抗體檢測；2、病原體檢測；3、免疫病理檢測；4、細胞表面抗原和受體檢測。@吉普塞舞神第32頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第九章酶免疫技術酶免疫技術：在酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應完成后，加入酶的相應底物，通過酶對底物的顯色反應，對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析。常用酶及其底物1、辣根過氧化物酶（HRP）：由無色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅素（輔基）結合而成的復合物。輔基是酶活性基團。底物：鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）應用廣泛2、堿性磷酸酶（AP）底物：對硝基苯磷脂酸（p-NPP）3、β-半乳糖苷酶（β-Gal）：因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標志物在測定時不易受到內源性酶的干擾，從而提高特異性，被用于均相酶免疫測定中。底物：4-MUU@吉普塞舞神第33頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第九章酶免疫技術酶免疫技術：1、酶免疫測定（EIA）：用于液體標本中抗原或抗體的定性和定量。2、酶免疫組織化學技術：用于組織切片或其他標本中抗原的定位。均相酶免疫測定利用酶標志物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發(fā)生改變的原理，可以在不將結合和游離酶標志物分離的情況下，通過測定標記酶的活性的改變而確定抗原或抗體的含量。異象酶免疫測定是目前應用最廣泛的一類，分為液相和固相酶免疫測定兩類。如ELISA。@吉普塞舞神第34頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第九章酶免疫技術ELISA三個必要的試劑：①固相的抗原或抗體；②酶標記的抗原或抗體；

③酶反應的底物?？乖瓬y定：①雙抗體夾心法：常用。②雙位點一步法：針對抗原上的兩個不同的抗原決定簇的兩種抗體，一個用來包被，一個用來酶標記。當抗原過量時可分別結合固相抗體和酶標記抗體，出現鉤狀效應。③競爭法：針對只有單個抗原決定簇的小分子?？贵w測定：①間接法：固相抗原-待測抗體-酶標抗抗體復合物。②雙抗原夾心法③競爭法：多用于乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗體（HBeAb）的檢測。④捕獲法：又稱反向間接法，常用病原體急性感染診斷中的IgM抗體。應用：ELISA可用于病毒（甲肝、乙肝兩對半等）風疹、皰疹、輪狀病毒等；細菌如結核、HP等，也用于各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標志物等。@吉普塞舞神第35頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十章化學發(fā)光免疫分析技術直接化學發(fā)光劑：1、吖啶酯；2、三聯(lián)吡啶釕酶促反應發(fā)光劑：標記酶有HRP和堿性磷酸酶；HRP催化的發(fā)光劑為魯米諾及其衍生物；AP催化的發(fā)光底物為AMPPO。@吉普塞舞神第36頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十一章生物素-親和素放大技術生物素（biotin，B）、親和素（avidin，A）生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）是一種以生物素和親和素具有的多級放大結合特性為基礎的實驗技術，既能偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質，又可被熒光素、酶、放射性核素等材料標記。生物素：可以標記蛋白質氨基、醛基、巰基和核酸。親和素（AV）和鏈霉親和素（SA）是生物素的天然特異性結合物。1個AV和SA能結合4個生物素分子，因此具有放大效應。@吉普塞舞神第37頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十一章生物素-親和素放大技術BAS的應用1、BAB法：也稱僑聯(lián)親和素-標記生物素法（BRAB），以游離的親和素

作為僑聯(lián)劑，利用親和素的多價性，將檢測體系中的抗原-生

物素化抗體復合物與標記生物素連接起來。

抗原-生物素+親和素+生物素-標記2、ABC法：預先按一定比例將親和素與酶標生物素結合，當其與反應體

系中的生物素化抗體相遇時，ABC中未飽和的親和素結合部位

即可與抗體上的生物素結合。

抗體-生物素+親和素-生物素-酶標復合物3、BA法：也叫LAB法，以標記親和素直接與免疫復合物中的生物素化抗

體連接進行檢測。

酶標記-親和素+生物素-抗體BAS用于熒光抗體技術，通常用BA法，用熒光素直接標記親和素。@吉普塞舞神第38頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十二章固相膜免疫測定

以微孔膜作為固相，固相膜的特點：多孔性、高度吸附抗體或抗原、易于漂洗，可被液體穿過流出，液體也可通過毛細管作用在膜上向前移行。標記物可用酶、彩色乳膠、膠體金、膠體硒等。常用固相膜：玻璃纖維素膜、尼龍膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜和

硝酸纖維素（NC）膜，最長用NC膜免疫金標記技術：標志物在配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。免疫滲濾實驗（IFA）用于檢測各種傳染病的抗體和腫瘤標志物等。用以檢測尿液HCG的“金標”早孕診斷試劑也已廣泛使用。結果：膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點為陽性，反之陰性。免疫層析實驗（ICA）：常用膠體金，稱為金免疫層析實驗（GICA）與IFA的不同在于液體的移動不是直向穿流，而是基于層析作用的橫流。結果：陰性為一條棕紅線條帶；陽性為兩條，無條帶為試劑失效。@吉普塞舞神第39頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十二章固相膜免疫測定斑點酶免疫吸附實驗（Do-ELISA）：與ELISA不同之處在于載體為蛋白質、NC膜，沒作用于底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。結果：陽性者在膜上出現肉眼可見的染色斑點，靈敏度比ELISA高。酶聯(lián)免疫斑點實驗（ELISPOT）：體外檢測特異性抗體分泌B細胞和細胞因子分泌T細胞。檢測活細胞。結果：陽性PVDF膜出現紫色斑點。1個斑點代表一個細胞，靈敏度高。應用非常廣泛：如移植中排斥反應的預測，疫苗發(fā)展、Th1/Th2分析、自身免疫性疾病研究、腫瘤研究、過敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學反應的篩選。免疫印跡法（WesternBlot）：常用多克隆抗體。@吉普塞舞神第40頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十三章免疫組織化學技術標本：1、活體組織：應取材于病變組織及病變與正常組織交織處。2、各種體液、穿刺液：直接涂片或經離心涂片。3、培養(yǎng)細胞：單層細胞直接固定。固定劑：10%福爾馬林制片方法1、冰凍切片：使抗原得到最大限度保存，但形態(tài)保存不佳2、石蠟切片：研究形態(tài)學的主要制片方法常用抗原暴露方法：微波法、高壓鍋法標本的保存：最好直接鏡檢，4℃干燥可保存1個月。但病毒和某些組織抗原標本抗原性喪失很快，需-20℃下保存。@吉普塞舞神第41頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十三章免疫組織化學技術酶免疫組織化學技術的優(yōu)點（與熒光免疫技術相比）：可長期保存、可用普通光鏡觀察、可觀察組織細胞的細微結構、敏感度高。1、直接法：將酶標記在特異抗體上，直接與組織內抗原反應。2、間接法：將酶標記在二抗上，先將一抗與相應的組織抗原結合，

再連接二抗。應用廣泛。免疫組化中常用的酶及顯色底物1、HRP：底物為二氨基聯(lián)苯胺（DAB），反應產物呈棕色。2、氨基乙基卡巴唑（AEC）：反應產物呈橘紅色。3、4-氯-1-萘酚：產物灰藍色。廣義的親和組織化學染色包括：抗原與抗體；植物凝集素與糖類；生物素與親和素；SPA與IgG；陽離子與陰離子；配體與受體。@吉普塞舞神第42頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十四章免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術外周血單個核細胞的分離密度梯度離心2份6%聚蔗糖蒸餾水+1份34%泛影葡胺生理鹽水，比重為1.077±0.002；作為淋巴細胞分離液，即Ficoll液。上到下依次為：稀釋的血漿層、單個核細胞層、粒細胞層和紅細胞層。淋巴細胞的分離利用單核細胞在37℃和Ca2+存在時，能主動黏附在玻璃、塑料等材料上的特性，從單個核細胞懸液中去除單核細胞，從而獲得淋巴細胞。也可用Percoll分離液法。分離細胞的保存1、短期保存：將細胞用含10%~20%滅活小牛血清的培養(yǎng)液稀釋重懸，4℃保存。2、長期保存：液氮，加DMSO?；盍y定：臺盼藍藍色，活細胞不著色，死細胞呈藍色。@吉普塞舞神第43頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十四章免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術淋巴細胞表面標志及亞群分類一、T細胞表面標志及其亞群T細胞共同的標志抗原：CD3輔助性T細胞（Th）：CD3+CD4+CD8-；細胞毒性T細胞（Tc/CTL）：CD3+CD4-CD8+；調節(jié)性T細胞（Tr/Treg）：CD4+CD25+。CD2：表達于全部人T細胞和NK細胞，因能與綿陽紅細胞（SRBC）

結合，又稱綿羊紅細胞受體。CD3：表達于全部T細胞表面，是TCR-CD3復合物的重要組成部分。CD4/CD8：表達CD4的主要是輔助性T細胞、表達CD8的主要是細胞

毒性T細胞。其他表面標志：致有絲分裂受體①輔助性T細胞分為：Th1、Th2Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等細胞因子輔助細胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應，本身具有明顯的細胞毒作用。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等細胞因子輔助體液免疫，參與速發(fā)型超敏反應，但本身不具有明顯的細胞毒作用。②細胞毒性T細胞分為：Tc1、Tc2都有典型的細胞毒作用。@吉普塞舞神第44頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十四章免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術淋巴細胞表面標志及亞群分類二、B細胞表面標志B細胞的重要表面標志：膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受體、補體受體、EB病毒受體、小鼠紅細胞受體。SmIg為B細胞特有，是鑒定B細胞的可靠指標。SmIg又稱BCR，mIg的主要作用是結合特異性抗原，故又稱抗原受體。成熟的B細胞的mIg主要為mIgM和mIgD。B細胞的表面特異CD分子有CD19、CD20、CD21、CD22和CD23等。B細胞及其亞群的檢測是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫調節(jié)紊亂的重要指標。三、NK細胞表面標志NK細胞典型標志：CD3-CD16+CD56+CD16分子又稱為低親和性IgGFc受體，行使針對靶細胞的定向非特異性殺傷作用，也即NK細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）。@吉普塞舞神第45頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十四章免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術其他免疫細胞抗原遞呈細胞（APC）①“專職”抗原遞呈細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞，它們均可表達MHC-Ⅱ類分子；②“非專職”抗原遞呈細胞，包括內皮細胞、上皮細胞和激活T細胞等。單核-吞噬細胞系統(tǒng)（MPS）典型表面標志是CD14。DC細胞的主要特征表面標志是CD1a、CD11c和CD83。免疫細胞表面標志的檢測方法：1、抗體致敏花環(huán)法2、免疫細胞化學法3、免疫熒光法4、流式細胞分析法CD4/CD8比值升高常見于自身免疫性疾??；而CD4/CD8比值降低常見于病毒感染、惡性腫瘤和再障等。@吉普塞舞神第46頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十五章免疫細胞功能檢測技術一、淋巴細胞的功能檢測體內試驗：主要是進行遲發(fā)型超敏反應，借此間接了解淋巴細胞對

抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應；體外試驗：主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增值反

應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產物的測定。（一）T細胞功能試驗1、T細胞增殖試驗體外刺激物：植物血凝素（PHA）、刀豆素A、白喉類毒素、破傷

風類毒素、白色念珠菌等。2、T細胞分泌功能測定分別檢測細胞因子的含量、生物活性和基因表達水平。3、T細胞介導的細胞毒試驗適當的靶細胞（腫瘤細胞）與待檢淋巴細胞共培養(yǎng)，觀察腫瘤細胞殺傷情況。4、體內試驗正常機體對某種特殊抗原建立了細胞免疫后，如用相同抗原做皮膚試驗，常可出現陽性的遲發(fā)型超敏反應。目前臨床上用來診斷某些病原生物感染（結核、麻風等）和細胞免疫缺陷等疾病。結核菌素皮膚試驗；PHA皮膚試驗用于檢測機體的細胞免疫水平。@吉普塞舞神第47頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十五章免疫細胞功能檢測技術（二）B細胞功能檢測1、B細胞增殖試驗：小鼠B細胞用LPS刺激；

人B細胞用含SPA的金黃色葡萄球菌及抗IgM抗體刺激。2、溶血空斑試驗：經典溶血空斑試驗：檢測動物抗體形成細胞的功能。被動溶血空斑試驗：人抗體形成細胞產生的Ig與SRBC上的抗原結合，

在補體作用下出現溶血反應。3、酶聯(lián)免疫斑點實驗（ELISPOT）既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。4、體內試驗常用白喉毒素、破傷風毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等，將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并與免疫前后分別采血，測定受試者相應抗體效價，判斷B細胞功能。（三）NK細胞活性測定NK細胞與腫瘤細胞共同培養(yǎng)，觀察腫瘤細胞的存活情況。測定人NK細胞常用K562細胞株；測定小鼠NK細胞活性常用YAC-1細胞株。@吉普塞舞神第48頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十五章免疫細胞功能檢測技術二、吞噬細胞功能檢測技術（一）中性粒細胞功能檢測1、趨化功能檢測Boyden小室法、瓊脂糖平板法2、吞噬和殺菌功能測定顯微鏡檢查法、溶菌法、NBT還原實驗（二）巨噬細胞功能檢測1、炭粒廓清試驗2、吞噬功能檢測3、巨噬細胞溶酶體酶的測定4、細胞毒作用測定5、巨噬細胞促凝血活性測定@吉普塞舞神第49頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十六章細胞因子與細胞黏附因子的測定細胞因子的本質是蛋白質或多肽；黏附分子的本質是糖蛋白。常見的測定方法：分子生物學測定基因或mRNA；

生物活性測定；生物活性測定法1、促進細胞增殖和抑制細胞增殖測定法常用放射性核素摻入法和MTT比色法2、細胞毒活性測定法對指示細胞具有破壞作用的細胞因子，會導致細胞死亡，檢測細胞死亡數作為檢測指標，本法常用作TNF等測定。3、抗病毒活性測定用于IFN等細胞因子的檢測。4、趨化活性測定法趨化因子誘導中性粒細胞、單核-巨噬細胞或淋巴細胞等定向遷移，其誘導遷移的方式包括趨化性和化學增活性。趨化性：誘導細胞由趨化因子低濃度處向趨化因子高濃度處定向移

動的特性。采用Boyden小室趨化試驗測定。化學增活性：指細胞因子增強細胞隨機運動的能力，采用瓊脂糖小

滴化學動力學試驗測定。@吉普塞舞神第50頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十六章細胞因子與細胞黏附因子的測定免疫測定方法1、ELISA法：測定細胞因子和可溶性黏附分子。2、流式細胞分析：主要檢測細胞內細胞因子和細胞表面黏附分子。3、酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）：

用于類風濕因子、IFN-γ等細胞因子分泌細胞的定量測定。@吉普塞舞神第51頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十七章流式細胞儀分析技術及應用FCM常用染料有：異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白類（PE）、羅丹明AID檢測中的應用T淋巴細胞總數減少、T細胞亞群CD4Th/CD8Tc比例倒置，Th/Tc＜1，Th細胞數量顯著下降，Tc細胞正常，NK細胞減少或活力下降，B淋巴細胞處于正常范圍。自身免疫性疾病相關HLA抗原分析強直性脊柱炎：外周血HLA-B27的表達及表達程度與疾病發(fā)生有很

高的相關性。@吉普塞舞神第52頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十八章體液免疫球蛋白測定一、血清IgG、IgA、IgM測定IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白，其中IgG1最多、IgG4最少。

是血液和細胞外液中的主要抗體，也是機體再次免疫應答的

主要抗體，大多數抗感染抗體與自身抗體都是IgG。IgA：血清型主要以單體形式存在；

分泌型由J鏈連接的二聚體和分泌成分組成。

是參與黏膜局部免疫的主要抗體，分布于胃腸道和支氣管分

泌液、初乳、唾液和淚液中。IgM：五聚體、分子量最大，又稱巨球蛋白，主要存在于血液中。

是個體發(fā)育中最早合成和分泌的抗體，也是抗原誘導的體

液免疫中最早出現的抗體。測定方法：單向環(huán)狀免疫擴散法、免疫比濁法。臨床意義：1、IgG分子量小、可透過胎盤，故新生兒血液中IgG含量接近成人。2、3中Ig均升高：見于慢性肝臟疾病。3、IgG升高：見于慢性細菌性感染，如慢性支氣管炎、肺結核。4、IgM升高：宮內感染、類風濕性關節(jié)炎。5、SLE（系統(tǒng)性紅斑狼瘡）：IgG、IgA升高。@吉普塞舞神第53頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月一、血清IgG、IgA、IgM測定單一免疫球蛋白升高：指患者血清中某一類免疫球蛋白顯著增多，大多在30g/L以上，稱為單克隆蛋白（MP），也叫M蛋白。此類異常增多的免疫球蛋白多無免疫活性，又稱副蛋白。見于免疫增殖病，如多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、惡性淋巴瘤、

重鏈病、輕鏈病等。免疫球蛋白降低：先天性：見于體液免疫缺陷病和聯(lián)合免疫缺陷病。獲得性：IgA缺乏，易發(fā)生反復呼吸道感染；IgG缺乏，易發(fā)生化膿性感染；IgM缺乏，易發(fā)生革蘭氏陰性菌敗血癥。第十八章體液免疫球蛋白測定@吉普塞舞神第54頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十八章體液免疫球蛋白測定二、血清IgD和IgE測定IgD：膜結合型IgD（mIgD）構成B細胞BCR，是B細胞成熟的標志。未成熟B細胞僅表達mIgM，成熟B細胞同時表達兩種。

活化的B細胞或記憶B細胞mIgD逐漸消失。IgE：含量最少，主要由黏膜下淋巴組織中的漿細胞分泌。

IgE為親細胞抗體，可誘發(fā)Ⅰ型超敏反應，也和抗寄生蟲有關。檢測方法：ELISA三、尿液及腦脊液Ig測定1、尿液中Ig測定正常人尿液中Ig含量極微，腎小球濾過膜損傷輕微時，尿液中IgG濾出增多；濾過膜損傷嚴重時，分子量較大的IgM也開始濾出。臨床常選用測定尿液和血液中轉鐵蛋白（TRF）和IgG含量，計算選擇性蛋白尿指數（SPI），評估腎小球濾過膜的受損程度。SPI≤0.1：見于微小病變型腎??；SPI≥0.2：見于膜性腎病、膜增殖性腎炎與腎病綜合征。@吉普塞舞神第55頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十八章體液免疫球蛋白測定三、尿液及腦脊液Ig測定2、腦脊液Ig測定臨床上通過測定白蛋白商值（QALB），即測定CSF（腦脊液）中白蛋白和血清白蛋白比值來反應血腦屏障受損程度。商值＜9，血腦屏障無受損；9~15，輕度受損；15~33，中度受損；33~100，重度受損；＞100，完全破裂。QALB輕度升高，見于急慢性病毒感染；QALB中度升高，見于急性神經疏螺旋體?。籕ALB重度升高，見于化膿性腦膜炎、結核性腦膜炎等細菌性感染。腦脊液IgG測定采用速率散射免疫比濁法，腦脊液采集后應離心再測定。四、M蛋白測定及臨床意義1、血清蛋白區(qū)帶電泳技術：篩選M蛋白的經典方法。2、血清免疫球蛋白定量測定：包括單向免疫擴散和比濁法，是檢

測M蛋白的初篩試驗。3、免疫電泳：鑒定M蛋白的常規(guī)方法。4、免疫固定電泳：臨床鑒定M蛋白最常用的方法。

利用區(qū)帶電泳和特異性抗血清的免疫沉淀反應。@吉普塞舞神第56頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十八章體液免疫球蛋白測定五、輕鏈測定及其臨床意義1、本-周蛋白測定方法：化學法（加熱沉淀法）和免疫法檢測本-周蛋白是對輕鏈病的診斷必不可少的項目。輕鏈病患者尿中可測得本-周蛋白，血中反而陰性，因為分子量小，極易從腎臟排出。2、κ-Ig和λ-Ig定量測定方法：單向免疫擴散法和免疫比濁法。六、冷球蛋白的測定冷球蛋白又稱冷免疫球蛋白，一般在-4℃發(fā)生沉淀，37℃復溶。Ⅰ型：單克隆冷球蛋白，常見IgG、IgM、IgA，多見于免疫增生

性疾病，如多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥。Ⅱ型，單克隆混合型冷球蛋白，最常見的組合為IgM-IgG。多見

于自身免疫性疾病，如類風濕關節(jié)炎。Ⅲ型，多克隆混合型冷球蛋白，多見于傳染性單核細胞增多癥、

病毒性肝炎、鏈球菌感染等感染性疾病。檢測冷球蛋白宜在體溫條件下采集和保存靜脈血。@吉普塞舞神第57頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十九章補體檢測及應用補體總活性測定以紅細胞的溶解為指示，以50%溶血為判斷終點，故稱CH50。通常CH50指基于經典途徑的CP-CH50。（classicpathway）原理：補體最重要的活性是溶細胞作用，特異性抗體與紅細胞結合后可激活補體，導致紅細胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分滲入，引起紅細胞腫脹破裂。溶血反應對補體的劑量依賴呈S型曲線，實驗常以50%溶血為終點指標，比100%溶血更為敏感，因此稱為補體50%溶血試驗（CH50）。該法主要檢測的是補體經典途徑的溶血活性，所得結果反應補體C1~C9等9種成分的綜合水平。如CH50測定值過低或完全無活性，應考慮補體缺陷，檢測補體單個成分。臨床意義：血清補體水平下降：①肝病或營養(yǎng)不良引起的蛋白質合成不足；②SLE、類風濕關節(jié)炎、強直性脊柱炎等自身免疫病活動期消耗補體。③細菌感染，旁路途徑活化消耗補體。血清補體水平升高：心肌梗死、甲狀腺炎、大葉性肺炎、糖尿病、妊娠等。@吉普塞舞神第58頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十九章補體檢測及應用單個補體成分測定檢測指標：C3、C4、C1q、B因子、C1酯酶抑制物等1、免疫溶血法指示系統(tǒng)：抗原為SRBC，抗體為抗SRBC的抗體，即溶血素。檢測補體的活性。2、免疫化學法待測血清中的C3、C4與相應抗體結合，反應介質中的PEG可使該復合物沉淀。檢測補體的含量。@吉普塞舞神第59頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第十九章補體檢測及應用補體結合實驗（CFT）利用補體的溶細胞作用檢測各種物理狀態(tài)的抗原抗體測定。實驗原理：1、反應系統(tǒng)：已知抗原（抗體）與待測抗體（抗原）；2、補體系統(tǒng)：多采用豚鼠血清；3、指示系統(tǒng)：致敏綿陽紅細胞。第一步：反應系統(tǒng)與補體作用；第二步：指示系統(tǒng)利用剩余補體作用。結果：不溶血為補體結合實驗陽性；溶血為實驗陰性。試驗中以50%不溶血作為判斷終點。補體測定的應用1、診斷梅毒螺旋體感染的華氏反應；2、HLA分型的補體依賴性細胞毒試驗；3、抗體形成細胞定量檢測的溶血空斑技術。@吉普塞舞神第60頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十二章感染性疾病與感染免疫檢測感染性疾病的早期診斷：病原體抗原和宿主抗血清。IgM抗體出現早，消失快，常作為感染的早期診斷指標；IgG類抗體出現晚，維持時間長，是流行病學調查的重要依據。一、細菌感染性疾病的免疫檢測抗細胞內感染：主要是細胞免疫；抗細胞外細菌感染：主要是B細胞介導的體液免疫。（一）鏈球菌感染1、鏈球菌最常用的免疫學檢查是抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）檢測。ASO增高常見于急性咽炎等上呼吸道感染、風濕性心肌炎、心包炎、風濕性關節(jié)炎和急性腎小球腎炎。2、豬鏈球菌實驗室檢查有細菌培養(yǎng)、鑒定和免疫學檢查。以及分子診斷技術。@吉普塞舞神第61頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月一、細菌感染性疾病的免疫檢測（二）傷寒沙門菌感染沙門菌可致多種感染，輕者為自愈性腸胃炎，重者可引起致死性傷寒。傷寒沙門菌的實驗室診斷主要依賴于免疫學檢測方法。1、肥達反應：血清凝集試驗傷寒沙門菌有菌體O抗原、鞭毛H抗原和表面Vi抗原，三者的抗體均為非保護性抗體。由于O抗原和H抗原的抗原性較強，常用作血清凝集試驗。2、ELISA：以傷寒沙門菌脂多糖成分為抗原，檢測傷寒患者血清

中的特異IgM成分。（三）結核分枝桿菌感染結核分枝桿菌（TB）進入人體后，可以誘導機體產生抗感染的細胞免疫，也能產生抗結核分枝桿菌的抗體反應。1、結核菌素試驗：包括針對舊結核菌素（OT）與結核菌素純蛋

白衍生物（PPD）兩種菌體蛋白。2、分枝桿菌抗體檢測：膠體金法。3、全血干擾素測定：鑒定菌種。第二十二章感染性疾病與感染免疫檢測@吉普塞舞神第62頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十二章感染性疾病與感染免疫檢測二、真菌感染性疾病的免疫檢測臨床上將真菌分為：淺部真菌和深部真菌臨床上的HIV患者、放化療腫瘤患者、長期使用糖皮質激素的患者以及使用免疫抑制劑的受移植者中真菌感染顯著增加。（一）深部真菌感染1、念珠菌感染；2、隱球菌感染；3、曲霉感染；深部真菌感染缺乏特意癥狀和體征，取材困難，多采用免疫血清法。（二）類真菌感染卡式肺孢子菌，又稱卡氏肺孢子蟲。多依賴形態(tài)學檢查，呼吸道分泌物或肺活檢組織切片染色見肺泡內泡沫狀嗜伊紅物質中富含本病原體。三、病毒感染性疾病的免疫檢測（一）流感病毒感染1、病毒抗原檢測：早期診斷2、抗體檢測：血凝抑制試驗或補體結合實驗3、禽流感病毒：A型禽流感病毒（AIV）針對特異性抗體檢測。（二）輪狀病毒感染人輪狀病毒（HRV）引起腸炎和腹瀉，主要檢測抗原和抗體。@吉普塞舞神第63頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十二章感染性疾病與感染免疫檢測三、病毒感染性疾病的免疫檢測（三）肝炎病毒感染1、甲肝HAV：ELISA或化學發(fā)光檢測IgM或IgG。2、乙型肝炎病毒（HBV）①乙型肝炎表面抗原（HBsAg）：早期診斷的重要指標。②乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）：陽性提示感染后的康復；HBV疫苗接種者血中是否能檢出抗-HBs，是衡量預防接種效果的最重要指標。HBsAg含量消失同時伴抗-HBs的出現，是臨床上慢性乙肝治療的最終目標。③乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）：乙型肝炎傳染性的標志。④乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）：多出現于急性肝炎恢復期。HBeAg含量消失同時伴抗-HBe的出現，是目前臨床上慢性乙型肝炎治療的近期目標。⑤乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）：是乙型肝炎病毒存在的直接標志，與HBV的復制正相關，可反映HBV的活動性及復制程度。⑥乙型肝炎病毒核心抗體-IgM（抗-HBc-IgM）早期HBV感染的特異性血清學標志，有助于區(qū)分慢性活動性和非活動性肝炎。@吉普塞舞神第64頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十二章感染性疾病與感染免疫檢測三、病毒感染性疾病的免疫檢測2、乙型肝炎病毒（HBV）⑦乙型肝炎病毒核心抗體-IgG（抗-HBc-IgG）⑧乙型肝炎病毒前S1抗原（pre-S1）：HBV外膜蛋白，在病毒入侵肝細胞中發(fā)揮作用。⑨乙型肝炎病毒前S2抗原（Pre-S2）：與HBV的感染和復制有密切關系。3、丙型肝炎病毒感染（HCV）針對特異性抗體HCV-IgG和HCV-IgM的免疫學檢測4、丁型肝炎病毒感染（HDV）目前檢查主要針對HDVAg、抗HDV總抗體、IgM、IgG。5、戊型肝炎病毒感染（HEV）HEV感染為自限性，一般無慢性化過程，也無慢性HEV攜帶者。實驗室免疫學檢查針對HEV-Ag、HEV-IgM、HEV-IgG。（四）冠狀病毒感染SARS的檢查主要針對血清中的IgM抗體，抗體效價4倍增長提示近期感染。@吉普塞舞神第65頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十二章感染性疾病與感染免疫檢測四、先天性感染的免疫檢測產前檢查4項“TORCH”：弓形蟲（TOC）、巨細胞病毒（HCMV）、風疹病毒（RUV）、單純皰疹病毒（HSV）。胎兒在母體內受到感染可導致流產、死胎、胎兒畸形、或出現嬰兒智力低下、視聽障礙等。五、寄生蟲感染的免疫檢測1、瘧原蟲感染瘧原蟲寄生于人體紅細胞和肝細胞，引起瘧疾。寄生于人體的瘧原蟲有間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲四種。抗體檢測：間接熒光抗體實驗。2、血吸蟲感染：環(huán)卵沉淀反應（COPT）：是一種抗原抗體反應。3、絲蟲感染：ELISA檢測絲蟲抗體。4、華支睪吸蟲感染華支睪吸蟲又稱肝吸蟲，寄生在人的肝膽管內引起肝膽病變。常采用Do-ELISA檢測其特異性抗體。5、豬囊尾蚴感染俗稱“囊蟲病”，檢測其抗原或抗體。@吉普塞舞神第66頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十三章超敏反應性疾病及其免疫檢測超敏反應：又稱變態(tài)反應，是機體對某些抗原初次應答致敏后，再次接觸相同抗原刺激時，所出現的一種以生理功能紊亂或組織細胞損傷為主的異常免疫應答。變應原：引起超敏反應的抗原物質，可以是完全抗原也可以是半抗

原，自身組織抗原也可以成為變應原。Ⅰ型超敏反應：速發(fā)型超敏反應Ⅱ型超敏反應：細胞毒型或細胞溶解型超敏反應Ⅲ型超敏反應：免疫復合物型或血管炎型超敏反應Ⅳ型超敏反應：遲發(fā)型超敏反應@吉普塞舞神第67頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十三章超敏反應性疾病及其免疫檢測

Ⅰ型超敏反應主要由IgE抗體介導產生，發(fā)生速度最快，常在第二次接觸相同抗原后數分鐘即出現臨床反應。特點：①超敏反應發(fā)生快，消退快；②較少發(fā)生嚴重的組織細胞損傷；③IgE介導，無補體參與；④具有明顯的個體差異和遺傳背景。變應原：①某些藥物或化學物質：如青霉素、磺胺；

②吸入性變應原：如花粉顆粒、塵螨排泄物、動物皮毛等；

③食物變應原：如奶、蛋、魚蝦、蟹貝等；

④某些酶類物質：變應素：IgE；依賴Th2型細胞活化。細胞：肥大細胞和嗜堿性粒細胞及嗜酸性粒細胞。@吉普塞舞神第68頁，課件共104頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十三章超敏反應性疾病及其免疫檢測

Ⅰ型超敏反應發(fā)生過程：①致敏階段：變應原首次進入機體后，選擇性誘導B細胞產生IgE抗體，使機體出于對該變應原的致敏狀態(tài)。細胞膜表面結合有特異性IgE的肥大細胞和嗜堿性粒細胞稱為致敏細胞。②激發(fā)階段：處于致敏狀態(tài)的機體再次接觸相同變應原時，變應原即與致敏靶細胞膜上的IgE抗體特異結合，導致細胞脫顆粒，釋放各種生物活性介質，如組胺、前列腺素等。③效應階段：釋放的生物活性介質作用于效應組織和器官，引起局部或全身性過敏反應。常見Ⅰ型超敏反應疾病1、全身性超敏反應①藥物過敏性休克：青霉素最為常見②血清過敏性休克：使用動物免疫血清2、局部超敏反應①呼吸道過敏反應：過敏性鼻炎和過敏性哮喘②消化道過敏反應③皮膚過敏反應：皮膚蕁麻疹、濕疹和血管神經性水腫等。@吉普塞舞神第69頁，課件共