分子生物學(xué)常用技術(shù)雜交

分子生物學(xué)常用技術(shù)雜交第1頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）DNA變性DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，形成單鏈無(wú)規(guī)則線團(tuán)樣DNA，稱為DNA變性。變性方法：1):加熱、2):DNA溶液的pH改變、3):有機(jī)溶劑等變性的DNA的特征：粘度下降、沉降速度增加、

浮力上升、紫外吸收增加。（二）DNA復(fù)性變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。第2頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第3頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第4頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子雜交的特點(diǎn):

高度特異性高度靈敏性已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù).廣泛應(yīng)用于:基因克隆的篩選酶切圖譜的制作基因序列的定量和定性分析基因突變的檢測(cè)等。第5頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雜交的雙方:

待測(cè)核酸序列+探針（probe）待測(cè)核酸序列:克隆的DNA片段未克隆化的基因組DNA細(xì)胞總RNA,mRNA。核酸分子雜交第6頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針：是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記而便于檢測(cè)的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段?；蚪MDNA探針

cDNA探針

寡核苷酸探針

RNA探針等

探針

第7頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、DNA探針

DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲得DNA探針?lè)N類很多:有細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。來(lái)源:

分子克隆PCR第8頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月２、cDNA探針

cDNA（complementaryDNA）探針是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對(duì)）。

無(wú)內(nèi)含子和非編碼序列

cDNA探針是目前應(yīng)用最為廣泛理想的一種探針。來(lái)源:

分子克隆RT-PCR第9頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點(diǎn)：

①:這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖、大量制備、方法簡(jiǎn)便。

②:不易降解（相對(duì)RNA而言），DNA酶活性一般能有效抑制。

③:DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。第10頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、RNA探針：

RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高,特異性強(qiáng)。

克隆載體體外轉(zhuǎn)錄(invitrotranscription)RNA探針容易降解第11頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、寡核苷酸探針：

根據(jù)已知的核酸序列，采用DNA合成儀合成一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段，亦可作為探針使用。若不知核酸序列，可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推倒出核酸順序，但要考慮到密碼子的兼并性。多用于克隆篩選和點(diǎn)突變分析。

人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點(diǎn)：

①短的探針比長(zhǎng)探針雜交速度快、穿透力強(qiáng)。

②可以在短時(shí)間內(nèi)大量制備。

③在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。

④可合成單鏈探針，避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。

⑤寡核苷酸探針可以檢測(cè)小DNA片段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測(cè)在序列中單堿基對(duì)的錯(cuò)配。第12頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點(diǎn)：①短的探針比長(zhǎng)探針雜交速度快、穿透力強(qiáng)。

②可以在短時(shí)間內(nèi)大量制備。

③在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。

④可合成單鏈探針，避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。

⑤寡核苷酸探針可以檢測(cè)小DNA片段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測(cè)在序列中單堿基對(duì)的錯(cuò)配。第13頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

篩選寡核苷酸針的原則：

①長(zhǎng)18～50bp，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)合成量低；較短探針特異性會(huì)差些。

②堿基成分：G+C含量為40%～60%，超出此范圍則會(huì)增加非特異雜交。

③探針?lè)肿觾?nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。

④避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)），如-CCCCC-。

⑤一旦選定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與核酸文庫(kù)中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。

第14頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月克隆探針：

前述三種探針(DNA,cDNA,RNA)均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。

克隆探針的優(yōu)點(diǎn)：

（1）:特異性強(qiáng)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言，較長(zhǎng)的序列復(fù)雜度高，隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會(huì)較短序列少；

（2）:可獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)，因?yàn)榭寺√结樰^寡核苷酸探針摻入的可檢測(cè)標(biāo)記基團(tuán)更多。

第15頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針的標(biāo)記核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵放射性同位素標(biāo)記:敏感度高輻射危害

最早采用,最常用的核酸探針標(biāo)記方法。

常用同位素:

32P、35S。

32P因其能量高，信號(hào)強(qiáng)，所以最常用。

半衰期:32P為14.3天、35S為87.1天、125I為60天、3H為12.3年第16頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)有：

缺口平移

DNA快速末端標(biāo)記用T4多核苷酸酶標(biāo)記DNA5'末端

隨引物延伸

聚合酶鏈反應(yīng)第17頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月缺口平移第18頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA快速末端標(biāo)記；3‘末端第19頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

隨引物延伸第20頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月非放射性標(biāo)記物有下述幾類：金屬如Hg熒光物質(zhì)如F2TC半抗原如地高辛、生物素酶類如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP）等不同的標(biāo)記物，所標(biāo)記探針的方法及檢測(cè)方法也各異。第21頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

固相雜交:將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。

優(yōu)點(diǎn):1):未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，2):膜上留下的雜交物容易檢測(cè),3):能防止靶DNA自我復(fù)性等。

常用類型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。

液相雜交:參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。核糖核酸酶保護(hù)分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）等核酸分子雜交方法第22頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Southern印跡雜交1975年，英國(guó)Southern創(chuàng)建DNA+DNA雜交:即將待測(cè)DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)移（?。┎⒐潭ㄔ诠滔嘀С治锷?，用已知DNA探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。第23頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用途：1):基因定性定量2):DNA物理圖譜3):基因變異重排4):基因限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）

5):疾病診斷探針:DNA探針Southern印跡雜交第24頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Southern雜交(Southernblotting)的主要步驟待測(cè)DNA樣品的制備、酶切待測(cè)DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備

Southern雜交雜交結(jié)果的檢測(cè)第25頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第26頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1．DNA的變性解鏈:數(shù)倍體積的1.5mol/L

NaCl和0.5mol/LNaOH中1小時(shí)2.中和:然后用數(shù)倍體積的1mol/LTris-HCl（pH8.0）和1.5mol/LNaCl溶液中和1小時(shí)3．轉(zhuǎn)移:變性DNA在硝酸纖維素膜,尼龍膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um）用6SSC浸泡30min，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，然后再在80℃真空干燥2horUVcrosslink。4．預(yù)雜交:預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚(yú)精DNA）。鮭魚(yú)精DNA需經(jīng)過(guò)剪切和DNA酶消化處理，調(diào)濃度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸變性10min，

Southern轉(zhuǎn)膜變性雜交:第27頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

5．雜交:

盡可能擠凈預(yù)雜交液，溶液的組成是6×SSC，0.01mol/L

EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚(yú)精DNA。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，時(shí)間一般為4-20h。

6．洗膜:2×SSC和0.5%SDS溶液室溫下漂洗5min,

2×SSC和0.1%SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動(dòng)),

0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動(dòng)保溫2h，洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3+0.41×(G+C）%]。

7．結(jié)果顯示:放射自顯影法，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影，定影即可.暴光通常在-20℃或-80℃,Phosphorimage定量第28頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第29頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)移緩沖液第30頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第31頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第32頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月121204cellclonesDNAdigestedwithEcoRI12345678910m1112131415161718191:12:33:124:385:406:417:568:639:6510:67M:1kbmarker11:7412:7513:7614:7715:7816:9517:9818:10119:235第33頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月AssaythecopynumberofprovirusinHT1080withSouthernblot191817161514131211M109876543211:12:33:124:385:406:417:568:639:6510:67M:1kbladder11:7412:7513:7614:7715:7816:9517:9818:10119:235第34頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月121004cellclonesDNAdigestedwithEcoRI12345678910m1112131415161718191:542:963:974:2245:2316:2327:2338;235/nondigested9:23610:239M:1kbladder11:24012:24413:24514:24815:25216:28617:29018:30119:313第35頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月AssaythecopynumberofprovirusinHT1080withSouthernblot191817161514131211M109876543211:542:963:974:2245:2316:2327:2338;235/undigested9:23610:239M:1kbmarker11:24012:24413:24514:24815:25216:28617:29018:30119:313第36頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Northern印跡雜交（Northernblotting）這是一種將待測(cè)RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印并固定到膜上、然后再與已知的DNA或RNA探針雜交的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交。Northern

印跡雜交的RNA轉(zhuǎn)移與Southern印跡雜交的DNA轉(zhuǎn)移方法類似，只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNA的2'-羥基基團(tuán)。RNA+DNA/RNA雜交第37頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用途：1):基因表達(dá)(mRNA)定性定量2):transcripts(mRNA)splicing

探針:DNA、RNA探針Northern印跡雜交第38頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Northernblotting第39頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法

1.試劑：10×MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L

EDTA

pH8.0。5×載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚藍(lán)。甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。20×SSC；去離子甲酰胺；50mmol/LNaOH(含10mmol/LNaCl)；0.1mol/LTris，pH7.5。第40頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.電泳步驟：（1）40ml水中加0.7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩沖液,

11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。（2）等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。（3）使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ul,10×MSE緩沖液2ul，甲醛3.5ul，去離子甲酰胺10ul。（4）55℃加熱15min，冰浴冷卻。（5）加2ul5×載樣緩沖液。第41頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（6）上樣、同時(shí)加RNAmarker/ladder。（7）60伏電泳過(guò)夜。（8）取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。（9）將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，

水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。（10）將膠浸到0.1mmol/LTrisHCl(pH7.5)中45min,使膠中和。（11）20×SSC洗膠1h。（12）20×SSC中過(guò)夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。（13）取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h第42頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Northernblot與Southernblot相似轉(zhuǎn)移方法與雜交程序:第43頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月042506ARNAgellingforsinglecopyHT1080clonesM10802496107115206228241243M1080249610711520622824124328S18S第44頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第45頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNAsplicing第46頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

核糖核酸酶保護(hù)分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）是一種高通量，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)NorthernBloting的mRNA定量檢測(cè)技術(shù)。

利用32P-（放射法）或生物素（非放法）標(biāo)記由多個(gè)目標(biāo)基因的DNA模板體外轉(zhuǎn)錄出的長(zhǎng)短不一的反義RNA探針，將含過(guò)量探針的溶液與樣品總RNA雜交，經(jīng)核糖核酸酶（RNase）處理后，未與探針雜交的單鏈RNA和過(guò)量的游離探針被降解，而目標(biāo)RNA則因與探針結(jié)合形成雙鏈而被‘保護(hù)’，則雜交雙鏈RNA的量代表了樣本中相應(yīng)基因的表達(dá)量。

核糖核酸酶保護(hù)分析液相雜交

第47頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月信號(hào)檢測(cè)：對(duì)于放射性RPA，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)被保護(hù)的探針的信號(hào)。

對(duì)于非放的RPA，雜交雙鏈經(jīng)過(guò)變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，UV照射使被保護(hù)的RNA探針與膜交聯(lián)而固定，再用試劑盒提供的鏈霉親和素－辣根過(guò)氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，這樣，再將膜放入暗盒中暴露于X射線膠片或者用CCD照相機(jī)檢測(cè)雜交探針的信號(hào)。根據(jù)適當(dāng)大小的探針片斷的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)定量待測(cè)樣本中該探針RNA代表的基因表達(dá)水平。

第48頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第49頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月放射性RPA放射性非放的RPA第50頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月凝膠真空干膠器

用于電泳后凝膠的干燥干燥時(shí)間：20-40min第51頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第52頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第53頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RPAvsNorthernBlot之優(yōu)勢(shì)：

1):過(guò)量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，

反應(yīng)更加完全

2):RPA比NorthernBlot靈敏15－150倍，適合檢測(cè)各種表達(dá)水平之基因

3):RPA通量高，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，可評(píng)價(jià)他們?cè)谕磺闆r下的差異表達(dá)4):快速,一次RPA就能完成10多次NorthernBlot的工作，加快研究速度第54頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1．菌落原位雜交（colonyin

situhybridization）

是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)、并與主平板上的菌落對(duì)位。第55頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟如下：①M(fèi)asterplate:將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。

②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。

③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。第56頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Masterplate第57頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月④5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。

⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/LNaCl,0.5mol/LTris-HClpH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min，重復(fù)中和一次。⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過(guò)的濾紙上，放置10min，SSPE配成20×貯備液：3.6mol/LNaCl,0.2mol/LNaH2PO4(pH7.4)，20mmol/LEDTANa2（pH7.4)。⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。第58頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月菌落原位雜交第59頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第60頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月菌落原位雜交第61頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

斑點(diǎn)雜交:是將被檢DNA/RNA點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本。

2．斑點(diǎn)雜交（Dotblot）。第62頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（1）DNA斑點(diǎn)雜交：

①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,

5μl(2~10μgDNA)。④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）RNA斑點(diǎn)雜交：

每個(gè)樣品至多加10μg總RNA溶于5μlDEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。第63頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第64頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5．組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）

組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而組織原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。

第65頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月原位雜交的探針:

單鏈或雙鏈DNA，RNA。長(zhǎng)度:100-400nt，過(guò)長(zhǎng)則雜交率減低。寡核苷酸探針（16-30nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針.

寡核苷酸探針,小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。原位雜交程序:組織細(xì)胞的固定預(yù)雜交雜交沖洗

放射自顯影/免疫酶法顯色以顯示雜交結(jié)果第66頁(yè)，課件共74頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月