動物細(xì)胞融合與單克隆抗體

動物細(xì)胞融合與單克隆抗體第1頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月動物細(xì)胞融合與單克隆抗體第2頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1、定義：兩個或多個不同的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞的過程。也稱細(xì)胞雜交一、動物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞：融合后形成的具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞成為雜交細(xì)胞。第3頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2、誘導(dǎo)融合的因素生物法：滅活的病毒誘導(dǎo)融合.(病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，使細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。)化學(xué)法：聚乙二醇PEG誘導(dǎo)融合.物理法：電激融合病毒顆粒黏附細(xì)胞表面細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞融合、形成雜種細(xì)胞不能，因為不滅活的病毒會感染細(xì)胞。第4頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)動物細(xì)胞融合的應(yīng)用1.突破有性雜交方法的局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。(至今種間、屬間、科間，甚至動物與植物之間的細(xì)胞融合已獲得成功。)2.成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。3.為制造單克隆抗體開辟了新途徑。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等第5頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月二、單克隆抗體

什么是抗體？抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。

B淋巴細(xì)胞（漿細(xì)胞）能產(chǎn)生抗體。第6頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）獲得抗體的傳統(tǒng)方法1、把某種抗原反復(fù)注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需的抗體。2、缺點：

產(chǎn)量低，純度低，特異性差。第7頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生多達(dá)百萬種以上的特異性抗體，但是每一個B細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞群。1、請從以上文字資料中找出單克隆抗體的概念用單個B淋巴細(xì)胞進(jìn)行克隆，得到的細(xì)胞群能夠分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體，這種抗體就叫做單克隆抗體。第9頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2、怎樣才能獲得單克隆抗體？提示1：僅用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可行嗎？提示2：我們所學(xué)的哪種細(xì)胞是可以無限增殖的？提示3：有什么方法能使B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力和腫瘤細(xì)胞無限增殖能力同時具備呢？第10頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性。利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞。利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。第11頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)

篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體第12頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月單克隆抗體的制備第13頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）單克隆抗體的制備第14頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月動物特異性免疫分離B淋巴細(xì)胞（B）；找到骨髓瘤細(xì)胞（G）。注意B淋巴細(xì)胞是一個系列。（B1,B2,B3,---Bn）細(xì)胞融合——三種融合方式:（BB;BG;GG）第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細(xì)胞（只有BG雜交瘤細(xì)胞存活。但BG雜交瘤細(xì)胞也是一個系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系列

，每孔只放一個雜交瘤細(xì)胞。“克隆化培養(yǎng)”每個雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內(nèi)即是所需要的雜交瘤細(xì)胞。單抗的制備過程要點：第15頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月動物特異性免疫分離B淋巴細(xì)胞（B）；找到骨髓瘤細(xì)胞（G）。注意B淋巴細(xì)胞是一個系列。（B1,B2,B3,---Bn）細(xì)胞融合——三種融合方式:（BB;BG;GG）第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細(xì)胞（只有BG雜交瘤細(xì)胞存活。但BG雜交瘤細(xì)胞也是一個系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系列

，每孔只放一個雜交瘤細(xì)胞?！翱寺』囵B(yǎng)”每個雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內(nèi)即是所需要的雜交瘤細(xì)胞。選擇所需要的雜交瘤克隆細(xì)胞群，體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。提取單克隆抗體。第19頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月3）、為何要進(jìn)行兩次篩選？4）、如何進(jìn)行第2次篩選？培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個雜交瘤細(xì)胞。第1次篩選得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。第2次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞群。問題強(qiáng)化：1）、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理2）、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體第20頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1、作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速特點.2、單克隆抗體的優(yōu)點：

特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備。3、單克隆抗體的應(yīng)用第21頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月單克隆抗體與早孕測試試劑主要成分：抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體原理：定性測定尿液中的人絨毛膜促性腺激素。（孕婦尿中的人絨毛膜促性腺激素能與抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合）從免疫學(xué)看，孕婦尿中的人絨毛膜促性腺激素是什么？第22頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1、作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速特點.2、用于治療疾病和運(yùn)載藥物：主要用于癌癥治療。生物導(dǎo)彈：單克隆抗體：導(dǎo)向。準(zhǔn)確找到癌細(xì)胞位置，原位殺死癌細(xì)胞。2、單克隆抗體的優(yōu)點：

特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備。3、單克隆抗體的應(yīng)用第23頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月為什么不用兩個而要用多個細(xì)胞進(jìn)行動物細(xì)胞間的融合？就目前常用的細(xì)胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細(xì)胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細(xì)胞。更重要的是，即使兩個細(xì)胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細(xì)胞類型。目前動物細(xì)胞融合技術(shù)最有價值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。第25頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振動、電激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合的方法細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性、植物細(xì)胞全能性原理動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項目植物體細(xì)胞雜交、動物細(xì)胞融合的比較第26頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月思考與探究1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動物細(xì)胞融合是兩個體細(xì)胞直接融合。第27頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。第28頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會兼有兩個親本細(xì)胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。第29頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1．在動物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較中，正確的是（）A．結(jié)果是相同的

B．雜種細(xì)胞的形成過程基本相同C．操作過程中酶的作用相同D．誘導(dǎo)融合的手段相同Ｂ第30頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是（）①淋巴細(xì)胞②小鼠骨髓瘤細(xì)胞③B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞④小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞⑤雜交瘤細(xì)胞

A．②④B．①③⑤

C．①②③④D．②③C第31頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月植物體細(xì)胞雜交的意義：打破生殖隔離，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育作物新品種。第32頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月一、動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合是正常的生命活動。

兩個細(xì)胞正在融合

受精作用第33頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)動物細(xì)胞融合的概念

動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交,是指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的過程。（二）動物細(xì)胞融合的過程與植物原生質(zhì)體融合原理相同，方法類似。雜交細(xì)胞:融合后形成的具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞。第34頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法化學(xué)法第35頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核第36頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）單克隆抗體的應(yīng)用

與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體特異性強(qiáng)，靈敏度高，并可大量制備。應(yīng)用主要有：1、作為診斷試劑2、用于治療疾病和運(yùn)載藥物準(zhǔn)確、高效、簡易、快速

把抗癌細(xì)胞的單克隆抗體與藥物相結(jié)合，制成“生物導(dǎo)彈”。第37頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月為什么滅活的病毒能作為誘導(dǎo)劑？因為滅活的病毒能使細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。不滅活的病毒能作為誘導(dǎo)劑嗎？不能，因為不滅活的病毒會感染細(xì)胞。第38頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。第40頁，課件共42頁，創(chuàng)作于202