基因診斷與基因治療

基因診斷與基因治療第1頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異由于先天遺傳背景的差異和后天內(nèi)、外環(huán)境的影響，人類的基因結(jié)構(gòu)及其表達的各個環(huán)節(jié)都可能發(fā)生異常，從而導(dǎo)致疾病。外源基因的入侵如各種病原體感染人體后，其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖而引起各種疾病。第2頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

基因診斷

GeneDiagnosis第3頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、基因診斷的概念、內(nèi)容和特點定義:

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。前提條件：已明確疾病表型與基因型的關(guān)系。第4頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月基因診斷的基本內(nèi)容檢測個體基因序列特征基因突變分析測定基因拷貝數(shù)基因表達產(chǎn)物分析測定是否存在外源基因第5頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

特點:1.以基因作為檢查材料和探查目標，屬于“病因診斷”，針對性強。2.分子雜交技術(shù)選用特定基因序列作為探針，故具有很高的特異性。3.由于分子雜交和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)都具有放大效應(yīng)，故診斷靈敏度很高。4.適用性強，診斷范圍廣。5.檢測外源基因時，可以檢測出潛伏的病原體。第6頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異由于先天遺傳背景的差異和后天內(nèi)、外環(huán)境的影響，人類的基因結(jié)構(gòu)及其表達的各個環(huán)節(jié)都可能發(fā)生異常，從而導(dǎo)致疾病。外源基因的入侵如各種病原體感染人體后，其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖而引起各種疾病。第7頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月二、基因診斷常用技術(shù)方法限制性內(nèi)切酶譜分析法DNA限制性長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecificoligonucleotide,ASO)（一）核酸分子雜交技術(shù)第8頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月×MstⅡ酶切位點(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第9頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第10頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

在人類基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對變異，中性變異導(dǎo)致個體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。在某一特定家族中，如果某一致病基因與特異的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可利用這一多態(tài)性片段作為一種“遺傳標志”，來判斷家庭成員或胎兒是否為致病基因的攜帶者。

DNA限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）第11頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月RLFP分析法第12頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。

第14頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月正常人純合突變雜合突變Leber病患者PCR/SSCP分析+﹣第15頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR/等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecificoligonucleotide，ASO)第16頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）基因測序即測定DNA序列的技術(shù)。分離患者的有關(guān)基因，測定出堿基排列順序，找出其變異所在，是最確切的基因檢測方法。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法。

第17頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）基因芯片

基因芯片(genechip)（又稱DNA芯片、生物芯片）通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。

應(yīng)用領(lǐng)域:基因表達譜分析、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預(yù)測、藥物篩選、基因測序等。

第18頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月三、基因診斷的應(yīng)用遺傳性疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定第19頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

基因治療

GeneTherapy第20頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月定義早期是指將外源正?；?qū)氚屑毎?，整合入細胞基因組，糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病以達到治療的目的一種治療方法。目前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達到治療疾病目的的方法。通過基因水平的操作而治療疾病的方法。

一、基因治療的概念第21頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1、基因修正（genecorrection）2、基因替代（置換）（genereplacement）3、基因增強（補償）（geneaugmentation）4、基因抑制（geneconstraint）和/或

基因失活（geneinactivation）5、免疫基因治療6、活化前體藥物基因（自殺基因）治療7、耐藥基因治療二、基因治療的策略第22頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月三、基因治療的種類1、生殖細胞（germcell）基因治療理論上將正常細胞基因轉(zhuǎn)移到患者的生殖細胞（精細胞，卵細胞早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體。這是理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中播散。2、體細胞（somaticcell）基因治療是指將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細胞，使之表達基因產(chǎn)物，以達到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。第23頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

四、基因治療方式一、體內(nèi)療法（invivo、一步法）將攜帶有治療基因的載體直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進入相應(yīng)的組織并進行表達。二、體外療法（exvivo、二步法）先把待接收基因的靶細胞從體內(nèi)取出，將攜帶有治療作用的載體導(dǎo)入培養(yǎng)細胞內(nèi)，篩選、增殖，再回輸體內(nèi)有關(guān)組織中。第24頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月目的基因+載體↓重組DNA↓受體細胞↓外源基因表達的篩選↓回輸體內(nèi)五、基因治療的基本程序第25頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1、為致病基因2、遺傳分子機制清楚3、該基因已被克隆，一級結(jié)構(gòu)和表達調(diào)控機制清楚4、可在體外操作，而且安全有效5、轉(zhuǎn)移基因能完整地、穩(wěn)定地整合，并能適時適量表達（一）目的基因的選擇原則第26頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、基因組DNA文庫

2、cDNA（complementaryDNA）

3、人工合成基因片段

4、PCR擴增

目的基因的來源第27頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）受體細胞的選擇原則1、最好選擇組織特異性細胞2、容易取出3、具有較長的壽命4、離體細胞能高效導(dǎo)入目的基因5、經(jīng)體外操作后能存活并安全回輸常用的的受體細胞：

淋巴細胞、造血干細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、骨骼肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、呼吸道上皮細胞、腫瘤細胞。第28頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）載體的選擇和外源基因的導(dǎo)入病毒載體

RNA病毒載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒）

DNA病毒：常用的有腺病毒、皰疹病毒、

SV40病毒、巨細胞病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒等非病毒載體

質(zhì)粒、脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)的蛋白第29頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

目前應(yīng)用最多的最成功的是逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒感染細胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。完整的病毒顆粒具有插入宿主染色體必需的全套酶系統(tǒng)，適用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）第30頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第33頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1、主要來自莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus，MoMLV）其中三個結(jié)構(gòu)基因（gag、pol、env）被刪除2、標記基因（markergene）插入空缺，供陽性選擇用。如：新霉素抗性基因（neomycinresistantgene），該基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（NPTⅡ），能對抗新霉素（G418）。3、有目的基因的插入位點逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建第35頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點1.可插入足夠長的外源DNA（7KB）2.基因轉(zhuǎn)移效率高，幾達100%3.重組體可整合入宿主染色體，并穩(wěn)定表達和傳代4.宿主范圍廣、比較安全缺點1.只能整合入分裂活躍的細胞2.靶細胞表面需要有特殊的受體3.必須使用帶有“輔助病毒”的包裝細胞系4.病毒滴度低第36頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月包裝細胞：一種細胞，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能在其中包裝成沒有感染能力的病毒顆粒，但能從中釋放出去，這種細胞即包裝細胞。1.多數(shù)由各種輔助病毒轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞系NTH3T3構(gòu)成。2.輔助病毒由MoMLV切除了病毒5’端LTR至Gag起始密碼之間包裝信號ψ等序列，雖能產(chǎn)生病毒蛋白但不能進行包裝。3.導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)錄出的RNA可以利用輔助病毒產(chǎn)生的病毒蛋白包裝成假病毒顆粒。包裝細胞系第37頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）外源基因表達的篩選

在較多的表達載體中都有neor標記基因存在，若向培養(yǎng)基中加入藥物G418，未被轉(zhuǎn)化的細胞不存在neor標記基因，細胞不能存活，最后只有轉(zhuǎn)化細胞存活下來。（五）回輸體內(nèi)第39頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1.選擇合適的疾?。簡位蜻z傳病2.具備該病分子缺陷的知識3.有目的基因的克隆4.克隆基因的有效表達5.克隆基因的有效調(diào)節(jié)6.可利用的動物模型遺傳病基因治療的必要條件四、基因治療的應(yīng)用（一）遺傳病的基因治療第40頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月基因治療的部分對象1.嚴重聯(lián)合免疫缺陷癥（腺苷脫氨酶ADA缺乏）2.囊性纖維變性3.Gaucher病Ⅰ型（葡糖腦苷脂酶缺陷）4.苯丙酮酸尿癥（苯丙氨酸羥化酶缺陷）5.血友病B（凝血Ⅸ因子缺陷）6.家族性高膽固醇血癥7.地中海貧血第41頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1.宿主的修飾：保護分裂旺盛的正常組織，如造血干細胞：導(dǎo)入二氫葉酸還原酶基因，獲得對氨甲蝶呤的抗性2.增強腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）活性：

如將腫瘤壞死因子（TNF）基因?qū)隩IL。這是目前腫瘤基因治療最常用的方法。3.腫瘤細胞的修飾（二）腫瘤的基因治療第42頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月如：自殺基因+病毒載體

轉(zhuǎn)染重組載體

藥物前體(無毒)Gene→酶→↓藥物復(fù)合物(有毒)

細胞死亡第43頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月例如：單純皰疹病毒哺乳動物細胞

HSVGene-TK

（在腫瘤細胞中表達，正常細胞中不表達）

Gene—TK

GCV（胸苷類似物）