基因工程藥物的分離純化

基因工程藥物的分離純化第1頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月第八節(jié)基因工程藥物的

分離純化

基因工程藥物的分離、純化非常重要。表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì)。它的制得具有以下特點(diǎn)：①表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；第2頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月②含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；③表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；④表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；⑤對(duì)其質(zhì)量要求純度高、無菌、無熱原。第3頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月一、建立分離純化工藝的根據(jù)⒈含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn)基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過程的各種因素對(duì)分離、純化工藝有影響。包括：①菌種的類型及其代謝特性。②原材料培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。③生產(chǎn)工藝及條件。第4頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⒉物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。⒊目的產(chǎn)物特性。⒋產(chǎn)品質(zhì)量的要求第5頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月二、分離純化的基本過程

發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離濃縮初步分離高度純化制劑產(chǎn)品包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性第6頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月三、分離純化的技術(shù)分離純化的技術(shù)要求：①技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。②選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達(dá)到較高的純化倍數(shù)。

第7頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月③收率要高。④兩個(gè)技數(shù)間能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理。⑤純化過程要快，滿足高生產(chǎn)率的要求。第8頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⒈細(xì)胞破碎與固液分離

⑴細(xì)胞收集：離心法、膜分離法。⑵細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法。⑶固液分離第9頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⒉目的產(chǎn)物的分離純化

目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來決定。

產(chǎn)物特性作用

等電點(diǎn)決定離子交換種類及條件相對(duì)分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時(shí)間第10頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⒉目的產(chǎn)物的分離純化

目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來決定。第11頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

產(chǎn)物特性作用等電點(diǎn)決定離子交換種類及條件相對(duì)分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時(shí)間

產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用第12頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月分離純化的方法依賴色譜分離方法

⑴離子交換層析（ionexchangechromatographyIEC）離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。

第13頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵反相色譜（reversedphasechromatography，RPC）和

疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）

反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來分離純化的。反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)與非極性固定相之間相互作用力的大小以及溶質(zhì)分子中極性基團(tuán)與流動(dòng)相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進(jìn)行分離的。第14頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

常用固定相為硅膠烷基鍵合相。流動(dòng)相為低離子強(qiáng)度的酸性水溶液，加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機(jī)溶劑。由于固定相骨架疏水性強(qiáng)，吸附的蛋白質(zhì)需用有機(jī)溶劑才能洗脫下來。第15頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

疏水色譜的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜介質(zhì)表面的疏水性弱。為有機(jī)聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。流動(dòng)相為pH6～8鹽水溶液。第16頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介子的疏水基團(tuán)產(chǎn)生疏水性作用而被吸附；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水性作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來，蛋白質(zhì)疏水性越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)。與反相色譜相比，疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)變性可能性小。第17頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⑶親和層析（affinitychromatography，AC）

親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。第18頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。載體：與配基結(jié)合的支撐物。

親和層析大體可分三步：①配基固定化②吸附目的物③樣品解吸第19頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⑷凝膠過濾

凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開。第20頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。主要應(yīng)用兩個(gè)方面：①脫鹽和更換緩沖液②蛋白質(zhì)分子的分級(jí)分離。在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。第21頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：⑴DNA的去除DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質(zhì)的去除熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除層析或過濾可將病毒去除。第22頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：⑴DNA的去除DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。第23頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵熱原質(zhì)的去除熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除層析或過濾可將病毒去除。第24頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月四、選擇分離純化方法

的依據(jù)

⒈根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮可用沉淀和超濾法。第25頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

產(chǎn)物在周質(zhì)表達(dá)是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)的一種形式,它可以避開可溶性表達(dá)蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質(zhì),在一定程度上有利于分離純化.為了獲得周質(zhì)蛋白經(jīng)低濃度溶菌酶處理后,可采用滲透壓休克的方法來獲得。第26頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

可溶性表達(dá)產(chǎn)物破菌后的細(xì)胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。第27頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⒉根據(jù)分離單元之間的銜接選擇

應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采用高效的分離手段。先將最多的雜質(zhì)去除，將費(fèi)用最高、最費(fèi)時(shí)的分離單元放在最后階段，即通常先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要雜質(zhì)（包括非蛋白類雜質(zhì)）。第28頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

隨后采用高分辨率的操作單元（離子交換層析和親和層析）凝膠過濾放在最后，這樣可以提高分離效果。層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨效率，并有利于各步驟間的過渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過濾。第29頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月⒊根據(jù)分離純化工藝的要求

來選擇