基因工程第一章核酸的制備

基因工程第一章核酸的制備第1頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸：遺傳信息的儲(chǔ)存物質(zhì)脫氧核糖核酸：deoxyribonucleicacid,DNA核糖核酸：ribonucleicacid,RNA區(qū)別：第2頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)天然DNA的制備（PreparationofDNA）一、DNA的組成與結(jié)構(gòu)（CompositionandStructureofDNA）:Aphosphategrouplinkedbyaphosphodiesterbondtoapentose(afive-carbonsugarmolecule)thatinturnislinkedtoanitrogen-andcarbon-containingringstructurecommonlyreferredtoasa“base”.BasePentosePhosphateGroupNucleotide第3頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月主要堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)：第4頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)構(gòu)：第5頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA第6頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA第7頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月解鏈溫度（Tm，meltingpoint）第8頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA分子雜交(HybridizationofDNAstrandsfromdifferentsources)第9頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月環(huán)狀DNA（CircularDNA）超螺旋DNA（supercoiledDNA，SC-DNA）；共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（CovalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）；開環(huán)DNA（opencircleDNA，oc-DNA）；線形DNA（linearDNA，L-DNA）第10頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月二、天然DNA的提?。≒urificationofDNA）(一)生物材料的準(zhǔn)備（PreparationofMaterial）：1.DNA的保存：1.1.70%的乙醇（Ethanol）1.2.TE溶液（Tris-Cl10mmol/LpH8.0，EDTA1mmol/L）1.3.低溫第11頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月2.大腸桿菌（E.coli）常見抗生素（Antibiotics）的使用：2.1氨芐青霉素（ampicillin，Ap）：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成，50～150μg/mL（水溶液）；2.2鏈霉素（streptomycin，Sm）：與細(xì)菌核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)(酶)的合成,使細(xì)菌不能正常生長(zhǎng)或者代謝而死亡，25～50μg/mL（水溶液）；2.3四環(huán)素（tetracycline，Tc）：與細(xì)菌核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，干擾核糖體上密碼子與反密碼子的相互作用，從而阻止氨?；鵷RNA同核蛋白體結(jié)合，5mg/mL（乙醇溶液）；2.4氯霉素（chloramphenicol，Cm）：與細(xì)菌核蛋白體50S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)合成，20μg/mL（乙醇溶液）；2.5卡那霉素（knamycin，Km）：與細(xì)菌核蛋白體蛋白基結(jié)合，并與較小的RNA亞基編譯區(qū)的特定堿基結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)合成，25～50μg/mL（水溶液）；第12頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)裂解細(xì)胞（Celllysis）：1.化學(xué)方法：1.1CTAB裂解法：CTAB（cetyltriethyammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），陽離子去污劑，與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液（＞0.7mol/LNaCl）中穩(wěn)定，在低鹽溶液（≤0.3mol/LNaCl）中沉淀。1.2SDS裂解法：SDS（sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸鈉），陰離子去垢劑，蛋白質(zhì)變性劑，有效沉淀多糖，與K離子形成絮狀沉淀，廣泛用于質(zhì)粒（plasmid）DNA的提取，蛋白質(zhì)的分離純化。第13頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月2.酶裂解方法：2.2蛋白酶K（ProteinaseK）裂解法：用于水解蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合緊密的組蛋白（Histone），廣泛用于動(dòng)物組織基因組DNA的提取，通常與SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解細(xì)胞。2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：通常用于細(xì)菌裂解，提取質(zhì)粒DNA，其原理是破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖支架，通過低滲透壓使細(xì)胞脹裂，引起細(xì)胞裂解。作用條件溫和，pH6.0～7.0，室溫25℃。第14頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）DNA的分離和抽提1.酚-氯仿抽提法：苯酚（phenol）-氯仿（chloroform）-異戊醇（isoamylalcohol）比例：25:24:1，苯酚：蛋白質(zhì)變性劑；氯仿：蛋白質(zhì)變性劑；并使變性的蛋白質(zhì)從水相層分離；異戊醇：防止產(chǎn)生泡沫。第15頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月2.氯化銫密度梯度離心法(CsCldensitygradientcentrifugation)；3.固相萃取法(solidphaseextraction,SPE)；第16頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月離心技術(shù)在基因工程中的應(yīng)用（ApplicationofCentrifugationtechniques）第17頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）DNA的純化（purification）和濃縮（condense）1.DNA的純化：1.1Rnase處理，去除RNA；1.2離子交換層析法；1.3氯化銫密度梯度離心法；1.4瓊脂糖電泳洗脫法；第18頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖電泳（Agarosegelelectrophoresis）1.安放好制膠模具（梳子和膠槽）第19頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月2.瓊脂糖凝膠澆灌并冷凝第20頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月3.移走梳子，暴露出上樣孔第21頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月4.瓊脂糖膠放置在電泳緩沖液中第22頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月5.上樣，通電流，直至DNA遷移到適當(dāng)位置第23頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月6.在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況第24頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA電泳完畢后的瓊脂糖凝膠第25頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況第26頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月不同凝膠的DNA電泳情況瓊脂糖凝膠（agarose）聚丙烯酰胺凝膠凝膠（PAGE）第27頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳儀（電源和電泳槽）第28頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月離子交換柱層析純化DNA第29頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月2.DNA的濃縮：2.1乙醇（Ethanol）沉淀法；2.2正丁醇（butylalcohol）抽提法；2.3聚乙二醇（PEG6000）濃縮法；第30頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成PCR反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程，在體外有酶催化合成特異性DNA片段。第31頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)簡(jiǎn)史1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……第32頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)簡(jiǎn)史1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第33頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月1.PCR的基本原理(MechanismofPCR)類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。其原理是通過高溫變性模板、引物與模板退火、引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以幾何級(jí)數(shù)倍增。第34頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555第35頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。第36頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第37頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：

10X緩沖液（Buffer）10μL4種dNTP混合物各200umol/L引物（Primer）各10～100pmol模板DNA（Template）0.1～2μgTaqDNA聚合酶0.5～

2.5UMg2+

1.5mmol/L第38頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)第39頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月70-75℃90-94℃37-60℃PCR循環(huán)第40頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍37-60℃90-95℃70-75

℃第41頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR擴(kuò)增No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 220=1,048,57630 230=1.07X1071cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第42頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU（空斑形成單位）

細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA第43頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）TaqDNA聚合酶（2）

PwoDNA聚合酶（3）TthDNA聚合酶（4）C.therm聚合酶4.2.1耐熱性DNA聚合酶第44頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）TaqDNA聚合酶1986年從一種75℃熱泉中的細(xì)菌(Thermusaquaricus)中分離純化出來的。95kDa，單分子酶，75℃活性最強(qiáng)。具有5’-3’合成活性和5’-3’外切活性,無3’-5’外切活性。95℃時(shí)半衰期為40分鐘。啟動(dòng)PCR反應(yīng)的能力很強(qiáng)，聚合速度快，在72℃的聚合速度為每秒30-100堿基。由于沒有3'-5'外切活性，在擴(kuò)增過程中有8.9-11x10-5

的錯(cuò)配率。第45頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）PwoDNA聚合酶來自古細(xì)菌Pyrococcuswoesei，由德國(guó)寶靈曼公司開發(fā)（BM），

90kDa，100℃的半衰期大于2小時(shí)，具有3’-5’外切活性，出錯(cuò)率低，使用較多的的且具有高保真度的PCR酶。第46頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）TthDNA聚合酶

來自嗜熱熱細(xì)菌（Thermusthermophilus），由Promega公司開發(fā)成商品。94kDa，95℃的半衰期為20分鐘。在Mg2+存在條件下以DNA為模板合成DNA，而在Mn2+存在下可以RNA為模板合成cDNA。因此可在高溫下做RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄PCR）反應(yīng)，避免RNA反轉(zhuǎn)錄過程中形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

第47頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）C.therm聚合酶來自Carboxydothermushudrogenoformans，以Mg2+為輔助因子的逆轉(zhuǎn)錄酶，最適溫度適60-70℃，同時(shí)也具有3’-5’外切酶校對(duì)活性，用于RT-PCR

反應(yīng)。第48頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2.2靶DNA/模板單、雙鏈DNA均可。純度：不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。使用濃度：一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。其兩端20-30bp序列用以一對(duì)引物的設(shè)計(jì)。第49頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月①引物長(zhǎng)度18～30bp，過短則降低特異性，過長(zhǎng)則會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時(shí)也增加引物合成的成本。②避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補(bǔ)序列（3個(gè)堿基），避免序列內(nèi)有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。③G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。4.2.3PCR引物第50頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月④引物3’末端堿基應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3’末端為G、C時(shí)引發(fā)效率較高。⑤引物5’末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列、ATG起始密碼子或啟動(dòng)子序列等)，便于克隆和表達(dá)。⑥引物用核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性，引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。第51頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2.4PCR原材料dNTP脫氧核苷三磷酸四種dNTP濃度應(yīng)相等要求：濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量第52頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2.5PCR緩沖液成分：10mmol/LTris-HCl(pH8.8室溫下)，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2。Mg2+：是DNA聚合酶的激活劑，0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性第53頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2.6PCR循環(huán)的溫度和時(shí)間溫度:90-95℃模板變性，復(fù)性（37-60℃），溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定；70-75℃引物在模板上延伸反應(yīng)時(shí)間變性30s，如果模板G+C含量高，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。復(fù)性30s。延伸1kb1min充足，由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定。循環(huán)次數(shù)

25～35

次。第54頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月25μLPCR反應(yīng)體系：模板DNA1μL（10－100ng）引物11μL（10μmol/L）引物21μL（10μmol/L）dNTP（10mmol/L）1μL（20mmol/L）10×PCR反應(yīng)的緩沖液2.5μLTaq酶0.5μL（1U/μl）ddH2O補(bǔ)至25μL4.3PCR擴(kuò)增DNA片段的方法常規(guī)程序第55頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)的程序：溫度（℃）時(shí)間（分鐘）(1)953-5(2)950.5(3)600.5(4)721(5)721025－30個(gè)循環(huán)第56頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)的操作注意事項(xiàng)：1）加樣操作必須在冰上進(jìn)行；2）加樣的順序：（1）從大到小；（2）先加藥品再酶：PCR反應(yīng)結(jié)果異常及解決辦法：1）無帶；2）雜帶多；3）DNA降解。第57頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR中應(yīng)注意的事項(xiàng)

防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作設(shè)立對(duì)照：陽性對(duì)照：陽性模板陰性對(duì)照：陰性模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分第58頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月4.4PCR技術(shù)應(yīng)用

4.4.1PCR技術(shù)的主要類型反向PCR錨定PCR不對(duì)稱PCR原位PCRRT-PCR重組PCR差異顯示PCR免疫PCR實(shí)時(shí)定量PCR多重PCR第59頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月1)反向PCR(reversePCR)方法：對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。用途：探索鄰接已知DNA片段的未知序列；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列第60頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月已知序列未知序列未知序列連接酶第61頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月2）不對(duì)稱PCR(asymmetricPCR)

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。

用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究第62頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月

高濃度引物低濃度引物第63頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月3）RT