南開大學(xué)-細(xì)胞生物學(xué)學(xué)習(xí)資源培訓(xùn)

南開大學(xué)—細(xì)胞生物學(xué)學(xué)習(xí)資源培訓(xùn)第十三章細(xì)胞的衰老

與凋亡人類自出生總要經(jīng)過生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老直至死亡的幾個(gè)階段，這是生命的必然規(guī)律。有機(jī)體是由無數(shù)個(gè)細(xì)胞組成，因此，在探討衰老與死亡時(shí)離不開細(xì)胞，對(duì)多細(xì)胞生物而言，細(xì)胞的衰老死亡和機(jī)體的衰老死亡是兩個(gè)概念。細(xì)胞的衰老死亡并不等于機(jī)體的衰老死亡，因?yàn)樵谟袡C(jī)體發(fā)育的不同階段，機(jī)體內(nèi)總是有細(xì)胞在不斷衰老與死亡。但細(xì)胞的衰老與機(jī)體的衰老卻又是密切相關(guān)的，大多數(shù)機(jī)體細(xì)胞都要經(jīng)未分化、分化到衰老直至死亡的歷程。因此，機(jī)體的衰老是以細(xì)胞總體的衰老為基礎(chǔ)的。細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，對(duì)細(xì)胞衰老過程的研究必然為老年學(xué)，甚至為腫瘤生物學(xué)的研究提供依據(jù)。第一節(jié)細(xì)胞衰老細(xì)胞衰老（cellsenescence)也稱細(xì)胞老化（cellaging),一般指細(xì)胞在形態(tài)與生化成分上的改變，進(jìn)而發(fā)生生理功能障礙的現(xiàn)象。這是一個(gè)緩慢行進(jìn)，隨細(xì)胞年齡增高而加劇的過程。現(xiàn)代人類面臨著三種衰老：第一種是生理性衰老，這是一切生物的普遍規(guī)律。第二是病理性衰老，使衰老現(xiàn)象提前發(fā)生，這種衰老又稱為早衰。第三種是心理性衰老，是由于各種原因，所產(chǎn)生未老先衰的心理狀態(tài)而影響機(jī)體的整體功能。對(duì)多細(xì)胞生物而言，細(xì)胞的衰老和死亡是兩個(gè)不同的概念，機(jī)體的衰老并不等于所有細(xì)胞衰老，但細(xì)胞的衰老是同機(jī)體的衰老緊密相關(guān)。正常人的成纖維細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下，即使條件適宜，其分裂次數(shù)也是有限的，并最終停止分裂而死亡。

Hayflick界限1961年Hayflick等報(bào)道，體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞具有增殖分裂的極限。他利用來自胚胎和成體的成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)胚胎的成纖維細(xì)胞分裂傳代50次后開始衰退和死亡，而來自成年組織的成纖維細(xì)胞只能培養(yǎng)15-30代就開始死亡。體外培養(yǎng)的年輕和老的人成纖維細(xì)胞的顯微形態(tài)只分裂了幾代的年輕成纖維細(xì)胞，呈現(xiàn)薄層、細(xì)長(zhǎng)的形態(tài)分離了50次的老的成纖維細(xì)胞，開始衰退，并很快死亡細(xì)胞體外衰老實(shí)驗(yàn)

Hayflick等還發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體細(xì)胞在體外可傳代的次數(shù)與物種的壽命有關(guān)。例如壽命為3年的小鼠，其培養(yǎng)細(xì)胞在體外的傳代次數(shù)只有12次；而龜?shù)膲勖蛇_(dá)200年，細(xì)胞可以傳140代。胎兒肺成纖維細(xì)胞可在體外條件下傳代50次，而成人肺成纖維細(xì)胞只能傳代20次，可見細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)。早老癥(Hayflick—Guilford綜合癥)及Werner氏綜合癥患者的成纖維細(xì)胞在體外只能傳代2—4次，其DNA合成亦較少，且細(xì)胞表面不具有正常成纖維細(xì)胞所具有的HLA（人白細(xì)胞抗原）抗原標(biāo)記。早老癥兒童與正常兒童的比較左邊是正常健康的9歲兒童，右邊是一個(gè)患早老癥的8歲兒童Hayflick的工作表明：細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的，而是有一定壽命的；他們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是著名的Hayflick界限。細(xì)胞衰老的決定Hayflick為了確定培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞的衰老是細(xì)胞本身決定的還是由于培養(yǎng)環(huán)境的惡化造成的。他又設(shè)計(jì)了巧妙的試驗(yàn)。將取自老年男性細(xì)胞(無巴氏小體）和年輕女性個(gè)體細(xì)胞(間期可見巴氏小體)進(jìn)行單獨(dú)或混合培養(yǎng)，結(jié)果混合培養(yǎng)中的兩類細(xì)胞的倍增次數(shù)與各自單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)相同。即在同一培養(yǎng)基中，當(dāng)年輕的細(xì)胞旺盛增殖時(shí)的同時(shí)，年老的細(xì)胞就停止生長(zhǎng)了。結(jié)果說明:決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境。年輕的細(xì)胞質(zhì)與年老的完整細(xì)胞融合時(shí)，得到的雜種細(xì)胞不能分裂；而年老的細(xì)胞質(zhì)與年輕的完整細(xì)胞融合時(shí)，雜種細(xì)胞的分裂能力與年輕細(xì)胞幾乎相同。結(jié)果說明:是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老的表達(dá)。至此，Hayflick界限為廣大的研究者所接受，認(rèn)為適用于很多種類型的細(xì)胞，對(duì)于這些細(xì)胞來說，衰老是不可避免的，衰老的原因在于細(xì)胞本身。為了更進(jìn)一步的探究體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞衰老的控制機(jī)理，他們又作了一個(gè)試驗(yàn)，就是用細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞，然后離心除去細(xì)胞核，得到胞質(zhì)體，在用胞質(zhì)體與完整細(xì)胞進(jìn)行雜交觀察雜種細(xì)胞衰老的表達(dá)。細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個(gè)體發(fā)育的早期也會(huì)發(fā)生。正常情況下終生保持分裂的細(xì)胞，其分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降？它們會(huì)不會(huì)衰老？

通過研究發(fā)現(xiàn)，終生保持分裂的小鼠上皮細(xì)胞，隨著年齡的增高，細(xì)胞周期長(zhǎng)度明顯延長(zhǎng)，究其原因，衰老動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要主要是G1期明顯延長(zhǎng)，分裂速度減慢，而S期的長(zhǎng)度變化不大。

◆衰老個(gè)體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老當(dāng)用近交系小鼠進(jìn)行系列皮膚移植實(shí)驗(yàn)時(shí)（即當(dāng)F1變老時(shí)，移植到F2身上，依次進(jìn)行延續(xù)移植），發(fā)現(xiàn)移植的皮膚可生活7-8年，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來供體的壽命，這表明衰老個(gè)體內(nèi)的環(huán)境因素影響了上皮細(xì)胞的增殖和衰老。

骨髓干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢另外，如果將老年動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)輻射處理，破壞其免疫干細(xì)胞，然后植入年輕動(dòng)物的骨髓干細(xì)胞，可觀察到年老受體動(dòng)物細(xì)胞免疫功能復(fù)壯。而如果移植的骨髓干細(xì)胞是來自年老的動(dòng)物，那么免疫反應(yīng)就仍然保持在較低的水平上，不會(huì)復(fù)壯。其關(guān)鍵在于供體與受體的年齡組合。如此得出的結(jié)論是：老年動(dòng)物干細(xì)胞的免疫缺陷只是在老年受體中才表達(dá)。老年動(dòng)物體內(nèi)似乎存在有阻抑細(xì)胞或阻抑因子，抑制了免疫反應(yīng)。衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化細(xì)胞在衰老過程中大致有以下主要特征。細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的衰老變化中最明顯的是核膜的內(nèi)折和染色質(zhì)固縮化；染色體端?？s短。糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量減少；致密體的生成;線粒體的數(shù)量減少，而體積增大;與衰老關(guān)系緊密的是線粒體DNA突變（主要是缺失突變），線粒體DNA突變隨年齡增大,并與衰老呈正相關(guān)。蛋白質(zhì)合成速率降低，原因是由于核糖體的效率和準(zhǔn)確性降低以及蛋白質(zhì)合成的延伸因子的數(shù)量和活性降低所致。細(xì)胞質(zhì)膜的粘性增加，流動(dòng)性降低。膜系統(tǒng)通常處于凝膠相或固相；磷脂含量逐步下降。細(xì)胞的間隙連接明顯減少，組成間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小。

細(xì)胞衰老的機(jī)理

細(xì)胞衰老是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過程，許多學(xué)者在這方面作過廣泛的研究。近幾十年來，有關(guān)細(xì)胞衰老的機(jī)制，提出了許多假說，但這些假說只是從不同側(cè)面和深度探索細(xì)胞衰老的原因，各自雖都有一定的科學(xué)依據(jù)，但大都不能解釋衰老的全部機(jī)理。(一）遺傳程序論該學(xué)說認(rèn)為衰老是遺傳的程序化過程，衰老是特定基因控制的。1.DNA修復(fù)能力下降表現(xiàn)為不同物種的DNA修復(fù)能力與物種各自的平均壽命呈正相關(guān)，即高壽命的物種比低壽命的物種具有更大的DNA修復(fù)能力；同一物種內(nèi)，個(gè)體的DNA修復(fù)能力與其所處的年齡呈負(fù)相關(guān)，即高齡個(gè)體的DNA修復(fù)能力小于低齡個(gè)體。認(rèn)為，這種DNA修復(fù)能力下降是由于基因因受損而表達(dá)異常，細(xì)胞功能失常，衰老逐漸形成。并認(rèn)為修復(fù)能力是生物體長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，由遺傳因素決定。2.端粒丟失說Herley等人對(duì)染色體端粒進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，每個(gè)端粒都是由250-1500個(gè)TTAGGG重復(fù)順序組成，是由端粒酶催化合成的。在正常體細(xì)胞中無端粒酶活性，不論何時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分裂，總有5-20個(gè)堿基對(duì)片段喪失，染色體將逐漸縮短，這樣還有多少可利用的端粒堿基對(duì)數(shù)量，似乎就能預(yù)示細(xì)胞還能分裂多久，就象細(xì)胞的衰老鐘一樣，端粒記錄著細(xì)胞的年齡并預(yù)言它的死亡。他們還發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可產(chǎn)生端粒酶，合成端粒片段，以取代那些丟失的片段。Herley也提示，分裂著的細(xì)胞中端粒的不斷丟失可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和糖尿病的發(fā)生。3、衰老基因?qū)W說統(tǒng)計(jì)學(xué)資料表明，子女的壽命與雙親的壽命有關(guān)，各種動(dòng)物都有相當(dāng)恒定的平均壽命和最高壽命，成人早衰癥病人平均39歲時(shí)出現(xiàn)衰老，47歲生命結(jié)束，嬰幼兒早衰癥的小孩在1歲時(shí)出現(xiàn)明顯的衰老，12?18歲即過早夭折。由此來看物種的壽命主要取決于遺傳物質(zhì)，DNA鏈上可能存在一些“長(zhǎng)壽基因”或“衰老基因”來決定個(gè)體的壽限。研究表明,當(dāng)細(xì)胞衰老時(shí)，一些衰老相關(guān)基因（SAG）表達(dá)特別活躍，其表達(dá)水平大大高于年輕細(xì)胞，已在人1號(hào)染色體、4號(hào)染色體及ⅹ染色體上發(fā)現(xiàn)SAG。在對(duì)線蟲的研究中，發(fā)現(xiàn)基因確可影響衰老及壽限，Caenrhabditiselegans的平均壽命僅3.5天，該蟲age-1單基因突變，可提高平均壽命65%，提高最大壽命110%，age-1突變型有較強(qiáng)的抗氧化酶活性，對(duì)H2O2、農(nóng)藥、紫外線和高溫的耐受性均高于野生型。在對(duì)早老綜合癥的研究中，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)解旋酶存在突變，該酶基因位于８號(hào)染色體短臂，稱為Wrn基因。也有很多例子不符合甚至反對(duì)基因程序論，最突出的例子是飲食對(duì)蜜蜂的影響，蜂王吃王漿可活六年之久，而工蜂3-6個(gè)月，蜂王漿可是蜜蜂的壽命提高了20倍。他們的壽命不同不是由于昆蟲遺傳基因不同，他們的基因組是相同的，只是由于飲食的不同。（二）自由基理論(free-radicaltheory)自由基指帶有未配對(duì)電子的粒子，因?yàn)閹в袉螖?shù)電子，所以極不穩(wěn)定，具有高度的化學(xué)反應(yīng)性，很容易和周圍的分子發(fā)生反應(yīng)，從而生成新的自由基。自由基種類繁多，其中以超氧陰離子自由基(·O2-)、羥自由基(·OH)等活性氧簇自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)的研究最為深入。氧自由基的損傷作用研究表明，自由基對(duì)生物體內(nèi)大分子產(chǎn)生極大的危害作用，攻擊的主要目標(biāo)是質(zhì)膜、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)、核內(nèi)的DNA以及胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。使質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸氧化；使蛋白質(zhì)中的羧基氧化造成蛋白質(zhì)交聯(lián)、變性、酶鈍化；使糖類化合物降解；使DNA鏈斷裂、交聯(lián)、堿基切除等，抑制蛋白質(zhì)、核苷酸和脂肪酸的生物合成。細(xì)胞內(nèi)清除過多的自由基的機(jī)制通過細(xì)胞內(nèi)部自身隔離，使產(chǎn)生自由基的物質(zhì)或位點(diǎn)與細(xì)胞其它組分分開；保護(hù)性酶：主要有超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)，兩者協(xié)同起保護(hù)性作用。其它抗氧化物分子，如維生素E和維生素C，它們都是自由基反應(yīng)的有效終止劑。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基以及防御自由基的系統(tǒng)之間的平衡被打破，自由基的累積增多，清除效率下降，同時(shí)伴隨著衰老的發(fā)生。關(guān)于人類的衰老和壽命問題

人類壽命有無極限？極限是多少？抗衰老，求長(zhǎng)壽，古往今來，人之常情，時(shí)至今日，更為人們所關(guān)注。研究表明：哺乳動(dòng)物自然壽命為生長(zhǎng)發(fā)育期的5—7倍，借此推論，人類完成生長(zhǎng)發(fā)育約在20~22周歲，自然壽命應(yīng)是100—150歲。

哺乳動(dòng)物的自然壽命為性成熟的8—10倍。

海弗里克（Hayflick）：人體細(xì)胞可進(jìn)行50次左右有絲分裂，每次細(xì)胞周期為2—4年，這樣推論，人的壽命應(yīng)在120歲左右。

1.遺傳與人類壽命：先天性，父輩主宰。父、母享有高壽，其子女往往也是高壽者。

2.壽命與性別有關(guān)：人壽保險(xiǎn)公司統(tǒng)計(jì)說明，♀性動(dòng)物＞♂性動(dòng)物，女人＞男人，為什么？眾說紛紜。3.環(huán)境與人類壽命：后天因素多樣錯(cuò)綜復(fù)雜。體魄、環(huán)境、心理、社會(huì)、營(yíng)養(yǎng)、疾病等。其中營(yíng)養(yǎng)及體力活動(dòng)較為重要。

4.職業(yè)與人類壽命：職業(yè)作為一種重要的社會(huì)因素，對(duì)人類壽命有一定的影響。日本統(tǒng)計(jì)，從事管理工作人員，平均壽命最長(zhǎng)，依次為國(guó)家機(jī)關(guān)工作人員、專業(yè)技術(shù)人員、商業(yè)工作人員、農(nóng)業(yè)工作人員、一般生產(chǎn)工人、體力勞動(dòng)者、礦工。

總得說來，近20年來，細(xì)胞衰老的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但離開真正揭示細(xì)胞衰老的本質(zhì)，還要走很長(zhǎng)的路。一旦揭開了細(xì)胞衰老的秘密，那么延緩衰老，延長(zhǎng)壽命將成為可能，但辯證唯物主義告訴我們，真正的長(zhǎng)生不老是不可能的。

我們研究了解細(xì)胞衰老死亡規(guī)律，目的并不是為了避免死亡，而是要延緩細(xì)胞衰老的到來。

我們謳歌生命，也不必詛咒死亡，有生必有死，無死亦無生，我們不贊成死亡，但長(zhǎng)生不死是進(jìn)化和發(fā)展的敵人。但愿我們每個(gè)人都能較長(zhǎng)時(shí)間生活在這個(gè)美好的世界，為人類的進(jìn)步與文明做更多的貢獻(xiàn)。第二節(jié)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡（cellapoptosis）是借用古希臘語，表示細(xì)胞象秋天的樹葉一樣凋落的死亡方式。1972年Kerr最先提出這一概念，他發(fā)現(xiàn)結(jié)扎大鼠肝的左、中葉門靜脈后，其周圍細(xì)胞發(fā)生缺血性壞死，但由肝動(dòng)脈供應(yīng)區(qū)的實(shí)質(zhì)細(xì)胞仍存活，只是范圍逐漸縮小，其間一些細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)變成細(xì)胞質(zhì)小塊，不伴有炎癥，后在正常鼠肝中也偶然見到這一現(xiàn)象。在細(xì)胞凋亡一詞出現(xiàn)之前，胚胎學(xué)家已觀察到動(dòng)物發(fā)育過程中存在著細(xì)胞程序性死亡（programmeddeath，PCD）現(xiàn)象，近年來PCD和細(xì)胞凋亡常被做為同義詞使用，但兩者實(shí)質(zhì)上是有差異的。首先，PCD是一個(gè)功能性概念，描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中，某些細(xì)胞的死亡是個(gè)體發(fā)育中一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格控制的正常組成部分，而凋亡是一個(gè)形態(tài)學(xué)概念，指與細(xì)胞壞死不同的受到基因控制的細(xì)胞死亡形式；其次，PCD的最終結(jié)果是細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞凋亡并非都是程序化的。2002年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者2002年10月7日英國(guó)人悉尼·布雷諾爾、美國(guó)人羅伯特·霍維茨和英國(guó)人約翰·蘇爾斯頓，因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。線蟲Caenorhabditiselegans是研究個(gè)體發(fā)育和細(xì)胞程序性死亡的理想材料。其生命周期短，細(xì)胞數(shù)量少，有1031個(gè)-131個(gè)=959(cells)神經(jīng)系統(tǒng)由302個(gè)細(xì)胞組成。這些細(xì)胞來自于407個(gè)前體細(xì)胞。這些前體細(xì)胞中有131個(gè)發(fā)生了程序死亡?？刂凭€蟲細(xì)胞凋亡的基因主要有3個(gè)Ced-3、Ced-4和Ced-9，Ced-3和Ced-4的作用是誘發(fā)凋亡。在缺乏Ced-3、Ced-4的突變體中不發(fā)生凋亡。有多余細(xì)胞存在。Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。使凋亡不能發(fā)生、Ced-9功能不足導(dǎo)致胚胎因細(xì)胞過度凋亡而死亡?！窀拍睿杭?xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的由基因決定的自動(dòng)結(jié)束生命的過程，也常常被稱為細(xì)胞程序死亡（programmedcelldeath，PCD）。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。一、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義

在發(fā)育過程中和成熟組織中，細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量是驚人的。健康人體內(nèi)，每小時(shí)約有10億個(gè)細(xì)胞凋亡。通過凋亡，保持機(jī)體的自穩(wěn)平衡，使有機(jī)體得以清除不再需要的細(xì)胞，而不引起炎癥反映。

鼠發(fā)育過程中足的成形過程

發(fā)育過程中手和足的形成過程就伴隨著細(xì)胞的凋亡。胚胎時(shí)期，他們呈鏟狀，以后指或趾之間的細(xì)胞凋亡，才逐步發(fā)育為成形的手和足。蝌蚪尾的消失當(dāng)蝌蚪變態(tài)成蛙時(shí)，蝌蚪尾內(nèi)的的細(xì)胞發(fā)生編程性細(xì)胞死亡，其結(jié)果是尾消失。變態(tài)期間出現(xiàn)的全部變化包括尾內(nèi)編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)都是被血液中胸腺激素含量升高所促進(jìn)的。脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過程中，約有50%的細(xì)胞凋亡，通過細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，使之與需要神經(jīng)支配的靶細(xì)胞的數(shù)量相適應(yīng)。胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生了過量的神經(jīng)細(xì)胞，它們競(jìng)爭(zhēng)靶細(xì)胞所分泌的生存因子，只有接受了足夠量的生存因子的神經(jīng)細(xì)胞才能存活。細(xì)胞調(diào)亡的生物學(xué)意義：生物發(fā)育過程中及成體組織中正常的細(xì)胞凋亡有助于保證細(xì)胞只在需要它們的時(shí)候和需要它們活的地方存活。這對(duì)于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用。二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征

壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到急性強(qiáng)力傷害時(shí)立即出現(xiàn)的早期反應(yīng)。包括胞膜直接破壞，大量水進(jìn)入細(xì)胞，線粒體外膜腫脹而密度增加。核染色質(zhì)呈絮狀，蛋白質(zhì)合成減慢。如及時(shí)去除傷害因素，以上早期反應(yīng)尚可逆轉(zhuǎn)。若傷害外因持續(xù)存在，則發(fā)生不可逆的變化。Ca2+升高、引起一系列變化，如細(xì)胞骨架破壞，溶酶體釋放，pH下降，最后細(xì)胞膜和細(xì)胞器破裂，DNA降解，細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起周圍組織炎癥反應(yīng).細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別是：①染色質(zhì)聚集、分塊、位于核膜上，胞質(zhì)凝縮，最后核斷裂，細(xì)胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；②凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器，還有凝縮的染色體，可被鄰近細(xì)胞吞噬消化，因始終有膜封閉，沒有內(nèi)溶物釋放，故不會(huì)引起炎癥；③線粒體無變化，溶酶體活性不增加；④內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀；⑤凋亡通常是生理性變化，而細(xì)胞壞死是病理性變化。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞質(zhì)緩慢收縮染色質(zhì)包裝和分離，細(xì)胞質(zhì)凝集核片段化發(fā)芽、起泡細(xì)胞裂成小片成為凋亡小體凋亡小體吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞凋亡的生化特征細(xì)胞凋亡的最主要特征是DNA發(fā)生核小體間的斷裂，結(jié)果產(chǎn)生含有不同數(shù)量核小體單位的片段，在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，形成了特征性的梯狀條帶(DNAladders)，其大小為180—200bp的整數(shù)倍。到目前為止，梯狀條帶仍然是鑒定細(xì)胞凋亡最可靠的方法。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)◆形態(tài)學(xué)觀測(cè)：染色法、透射和掃描電鏡觀察應(yīng)用各種染色法可觀察到凋亡細(xì)胞的各種形態(tài)學(xué)特征，有些染料如臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue)為活細(xì)胞排斥，但可使死細(xì)胞著色。DAPI是常用的一種與DNA結(jié)合的熒光染料。借助DAPI染色，可以觀察到細(xì)胞核的形態(tài)變化。Giemsa染色法可以觀察到染色質(zhì)固縮、趨邊、凋亡小體的形成等形態(tài)。此外，使用透視和掃描電鏡則可觀察凋亡細(xì)胞核的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化如染色質(zhì)因縮、凋亡小體的形成、細(xì)胞發(fā)泡等現(xiàn)象。有時(shí)也有用兩種染料進(jìn)行復(fù)染，以便更可靠地確定細(xì)胞凋亡的變化。例如用吖啶橙(AO)和溴乙錠(EB)進(jìn)行復(fù)染，AO只進(jìn)入活細(xì)胞，正常的細(xì)胞核及處于凋亡早期的細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色；EB只能進(jìn)入死細(xì)胞，將死細(xì)胞及凋亡晚期細(xì)胞的核染成橙紅色?！鬌NA電泳：細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，DNA發(fā)生特征性的核小體間的斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是180-200bp的整數(shù)倍。凋亡細(xì)胞中提取的DNA在進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴乙錠進(jìn)行染色時(shí)，這些大小不同的DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶。絕大多數(shù)凋亡細(xì)胞中DNA的斷裂都表現(xiàn)出這種特征.◆TUNEL測(cè)定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法TUNEL測(cè)定法(是terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)–mediateddUTPnickendlabeling的縮寫)，意指末端脫氧核苷酸移換酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法。這一方法能對(duì)DNA分子中3’-OH斷裂缺口進(jìn)行原位標(biāo)記。凋亡細(xì)胞的核DNA中產(chǎn)生的3’-OH末端，可借助一種可觀測(cè)的標(biāo)記物，如熒光素進(jìn)行原位標(biāo)記，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。◆彗星電泳法（cometassay）彗星電泳法(cometassay)的原理是將單個(gè)細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場(chǎng)中進(jìn)行短時(shí)間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細(xì)胞中形成的DNA降解片段，在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案；而正常的無DNA斷裂的核在泳動(dòng)時(shí)保持圓球形，這是一種快速簡(jiǎn)便的凋亡檢測(cè)法?！袅魇郊?xì)胞分析最常用來分析細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞技術(shù)是根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙錠使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時(shí)又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理●線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1Caspase家族與凋亡Caspase家族

Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase這種高度的特異性在蛋白酶中是很少見的。由于這種特異性，使caspase能夠高度選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，這種切割只發(fā)生在少數(shù)(通常只有1個(gè))位點(diǎn)上，主要是在結(jié)構(gòu)域間的位點(diǎn)上，切割的結(jié)果或是活化某種蛋白，或是使某種蛋白失活，但從不完全降解一種蛋白質(zhì)。caspase的研究源于線蟲(C.elegans)細(xì)胞程序化死亡的研究。研究發(fā)現(xiàn)有11個(gè)基因與線蟲PCD有關(guān)，其中ced3和ced4基因是決定細(xì)胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。線蟲細(xì)胞程序化死亡的研究促進(jìn)了其他動(dòng)物特別是哺乳類動(dòng)物中細(xì)胞凋亡的研究。人們發(fā)現(xiàn)哺乳類細(xì)胞中存在著Ced3的同源物ICE(interleukin1convertingenzyme)，Ced4的哺乳類同源物是Apaf1(即一種細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)，而Ced9的哺乳類對(duì)應(yīng)物是BCL2.現(xiàn)已確定至少存在11種caspase：這些caspases中，caspase1、11、4被認(rèn)為不直接參與凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們主要參與白介素前體的活化；而caspase2、8、9、10參與細(xì)胞凋亡的起始；參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的則是caspase3、、6、7，其中caspase3和7具有相近的底物和抑制劑特異性，它們降解PARP、DFF-45(DNAfragmentationfactor45)，導(dǎo)致DNA修復(fù)的抑制并啟動(dòng)DNA的降解。而caspase6的底物是laminA和keratin18，它們的降解導(dǎo)致核纖層和細(xì)胞骨架的崩解。caspase超家族成員及其相應(yīng)底物Caspase活化Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化，即在兩個(gè)亞基的連接區(qū)的天冬氨酸位點(diǎn)進(jìn)行切割而產(chǎn)生有兩個(gè)亞基組成的異二聚體。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的起始者（Caspase2、8、9、10）和執(zhí)行者（Caspase3、6、7）之間存在著上下游關(guān)系，即起始者活化執(zhí)行者。凋亡的起始者（Caspase2、8、10）的活化要求下列成員參與：

(1)配體/受體對(duì)，如FasL/Fas受體.(2)連接器或接頭蛋白FADD(3)修飾子蛋白(4)Caspase2、8、10的酶原。當(dāng)Fas受體為其天然配體FasL所啟動(dòng)時(shí)，就形成了Fas受體、連接器蛋白FADD和Caspase2、8、10的酶原組成的死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物。胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號(hào)分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部Procaspase相互活化并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡.下游Caspases活化后，作用于底物，裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬。Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個(gè)保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3。BCL-2家族成員二、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理（一）、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因?qū)Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞凋亡的基因凋控過程目前還不十分清楚，研究表明與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基都參于對(duì)細(xì)胞凋亡的凋控。其中研究較多的有bcl-2c-myc、p53、Ice、Fas/APO-1等。1、myc在許多人類惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有c-myc的過度表達(dá)，它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化。c-myc還參于細(xì)胞調(diào)亡的控制。在凋亡細(xì)胞中c-myc也是高表達(dá)。c-myc對(duì)增殖和凋亡的調(diào)節(jié)是一樣的。作為轉(zhuǎn)錄凋控因子，一方面激活那些控制細(xì)胞增殖的基因，另一方面也激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，給細(xì)胞兩種選擇：增殖或凋亡。當(dāng)生長(zhǎng)因子存在，bcl-2基因表達(dá)時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。2、bcl-2即：細(xì)胞凋亡抑制基因，名稱來源于B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/Leukemia-2，bcl-2)，最早由Tsujimoto（1985）從伴有14、18染色體易位的淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在正常人體內(nèi)位于18號(hào)染色體，在患者易位于14號(hào)染色體。bcl-2

是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一，能夠編碼bcl-2α（26KD）和bcl-2β（22KD）兩種蛋白質(zhì)，是膜的整合蛋白，主要存在于線粒體外膜、核膜及部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，它很少與其他生化機(jī)制已清楚的蛋白同源。bcl-2蛋白在正常組織自身穩(wěn)定方面起重要作用，bcl-2多出現(xiàn)在胸腺髓質(zhì)細(xì)胞、記憶B淋巴細(xì)胞、及壽命長(zhǎng)的干細(xì)胞群里，如皮膚、結(jié)腸、前列腺和子宮內(nèi)膜中，但很少出現(xiàn)在分化末期的上皮細(xì)胞中。bc1-2的功能相當(dāng)于線蟲中的ced9，bc1-2家族包括bcl-2、bax、bad、bcl-x等。bax基因是bcl-2基因家族的一員，其產(chǎn)物是一種與bcl-2同源的相關(guān)蛋白，能拮抗后者的生物學(xué)活性。bax的主要作用是加速細(xì)胞凋亡，并與bcl-2一起調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。bcl-2家族的成員通常以二聚體的形式發(fā)揮作用，bcl-2/bcl-2，bcl-2/bax和bcl-2/bcl-xL抑制細(xì)胞凋亡，而bax/bax，bax/bad和bcl-2/bax-xs促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bad也屬bcl-2基因家族，是bcl-2/bcl-xL相關(guān)死亡促進(jìn)因子，作為bcl-2/bcl-xL異二聚體伴分子而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。bcl-x通過剪切可形成bcl-xl和blc-xs兩個(gè)產(chǎn)物。bcl-xl與bcl-2同源，抑制細(xì)胞凋亡，而bcl-xs作用類似bax，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3、fasfas又稱作APO-1，屬TNF受體和NGF受體家族。1993年人白細(xì)胞分型國(guó)際會(huì)議統(tǒng)一命名為CD95。fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞等等。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。

4、ICE蛋白酶家族ICE蛋白酶參與Fas和TNFR1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，ICE與線蟲細(xì)胞凋亡基因ced-3同源，迄今已發(fā)現(xiàn)了11個(gè)同源基因，1996年后這些家族成員統(tǒng)稱為Caspase，能選擇性地切割蛋白質(zhì)使其失活或激活。ced-4在哺乳動(dòng)物中的同源體為Apaf-1(apoptoticproteaseactivatingfactor-1)，Apaf-1具有激活Caspase3(CPP32)的作用，而這一過程又需要其他兩個(gè)蛋白質(zhì)因子的參與：細(xì)胞色素c(Apaf-2)、Apaf-3。5、p53是一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是在細(xì)胞周期中監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細(xì)胞增殖。直到DNA修復(fù)完成。如果DNA不能被修復(fù)，則誘導(dǎo)其調(diào)亡，研究發(fā)現(xiàn)喪失P53功能的小鼠胸腺細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的調(diào)亡反應(yīng)和正常細(xì)胞相同，而對(duì)輻射誘導(dǎo)的調(diào)亡不敏感。（二）、Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fas具有三個(gè)半胱氨酸豐富的膜外區(qū)和一個(gè)稱為死亡結(jié)構(gòu)域（Deathdomain，DD，圖15-9）胞內(nèi)區(qū)，CD95的配體CD95L是TNF家族的一員，

當(dāng)CD95L或其他配體與CD95結(jié)合，CD95三聚化使胞內(nèi)的DD區(qū)形成一種構(gòu)象，它可以與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合，而后FADD的N端DED區(qū)（deatheffectordomain）就能