植物細(xì)胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)

植物細(xì)胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)第1頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四章植物細(xì)胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)第2頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)植物細(xì)胞的全能性1、定義：構(gòu)成植物體的任何一個(gè)細(xì)胞都具有該物種的全部遺傳信息，具有產(chǎn)生一個(gè)完整植株的潛在能力.在特定環(huán)境下，都可進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)立的完整個(gè)體。第3頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞全能性Totipotentiality第4頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、細(xì)胞的全能性的實(shí)現(xiàn)PlantTissue/organRemovedNewtissue/organMedium外植體explant

Newplantlet第5頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞分化（differentiation）：導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)、引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過(guò)程。細(xì)胞分裂細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞分化

植物組織/器官/個(gè)體第6頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第7頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞分裂細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞分化組織/器官/個(gè)體第8頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1）培養(yǎng)條件下的細(xì)胞脫分化脫分化（dedifferentiation):培養(yǎng)條件下使已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無(wú)分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過(guò)程。第9頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織（callus)愈傷組織——由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞。愈傷組織原是指生物在受傷以后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞。第10頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2）“生理脫離”效應(yīng)植物細(xì)胞或組織從完整的有機(jī)體上分離下來(lái)，脫離母體（離體）的影響，在適宜的條件下（培養(yǎng)），有利于激發(fā)植物細(xì)胞全能性的表達(dá)。第11頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1902年，Haberlandt對(duì)高等植物的葉肉細(xì)胞、髓細(xì)胞、腺毛細(xì)胞、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞、表皮細(xì)胞等材料進(jìn)行了離體無(wú)菌培養(yǎng)，雖然某些細(xì)胞存活了很長(zhǎng)時(shí)間，但始終沒(méi)能發(fā)生細(xì)胞分裂和增殖，大家推測(cè)一下他失敗的可能原因是什么？第12頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)條件不完善:培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不夠、缺少生長(zhǎng)激素等取材不當(dāng):植物細(xì)胞全能性的差異根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同而不同Whyfailed?植物細(xì)胞全能性的差異根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱為：頂端分生組織

>居間分生組織

>側(cè)生分生組織

>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導(dǎo)組織>厚壁組織。雙子葉植物的脫分化能力較單子葉植物和祼子植物強(qiáng)第13頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞分裂細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞分化脫分化再分化組織/器官/個(gè)體第14頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞再分化（redifferentiation):離體條件下，脫分化后具有分生能力的細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)細(xì)胞分化，重新形成各類組織和器官、形成為新個(gè)體的過(guò)程。3）培養(yǎng)條件下的細(xì)胞再分化第15頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月組織分裂生長(zhǎng)分化分生組織細(xì)胞分裂已分化組織細(xì)胞脫分化分裂生長(zhǎng)再分化器官植株愈傷組織離體條件下活體條件下

離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過(guò)細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的。第16頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、由愈傷組織再生植株的途徑121（1）1（2）第17頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月胚狀體(embryoid)的概念胚狀體(體細(xì)胞胚,Somaticembyo)：在植物組織培養(yǎng)中起源于非合子細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育形成的胚狀結(jié)構(gòu)。第18頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月體細(xì)胞胚發(fā)育再生成植株有兩個(gè)明顯的特點(diǎn)：

一是體細(xì)胞胚具有雙極性（doublepolarity）；二是體細(xì)胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)連系較少，即出現(xiàn)所謂的生理隔離（physiologicalisolation）現(xiàn)象。第19頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的條件環(huán)境條件：光照、溫度、濕度。營(yíng)養(yǎng)條件：培養(yǎng)基。第20頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、營(yíng)養(yǎng)條件——培養(yǎng)基第21頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基（Medium）：是為離體培養(yǎng)材料提供的近似于生物體內(nèi)生存的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，滿足其正常生長(zhǎng)和維持其完整結(jié)構(gòu)及功能。第22頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

無(wú)機(jī)鹽類：大量元素：C、H、O、N、P、K、S、Ca、Mg

微量元素：Mo、Co、Mn、Cu、Zn、Fe等有機(jī)營(yíng)養(yǎng)：碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖有機(jī)氮源：氨基酸類、酰胺類活性物質(zhì)：維生素類、肌醇、有機(jī)附加物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長(zhǎng)素類：IAA、NAA、IBA等細(xì)胞分裂素類：激動(dòng)素、玉米素等其它類：赤霉素、脫落酸、乙烯固化劑：瓊脂、明膠、卡拉膠等（一）培養(yǎng)基的組成第23頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

元素名稱添加形式

NKNO3,NH4NO3大量元素

PKH2PO4,NaH2PO4

K

KCl,KNO3,(≥0.5mmol/L

CaCaCl2·2H2O,Ca(NO3)2

·4H20或100mg/l)MgMg2SO4·7H2OSMg2SO4·

7H2O,Na2SO4微量元素

FeFe-EDTA(Na2-EDTA+FeSO4·7H2O

)BH3BO3MnMnSO4·7H2O(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OZnZnSO4·7H2O

IKICoCoCl3第24頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MurashigeandSkoogstocksolutions(MSMedium)MacroelementsMicroelements

(>0.5mmol/L)(<0.5mmol/L)MgSO4.7H2O0.37g/lKI0.83mg/lNH4NO3

1.65g/lH3BO36.2mg/lKNO3

1.9g/lMnSO4.4H2O22.3mg/lCaCl20.33g/lZnSO4.7H208.6mg/lKH2PO40.17g/lNa2MoO4.2H2O0.25mg/lCuSO4.5H2O0.025mg/lCoCl2.6H2O0.025mg/l

Na2.EDTA

37.3g/l

FeSO4.7H2O

27.8mg/l第25頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MSsaltsreducedto0.47g.l-1

MSsaltsincreasedto9.52g.l-1

培養(yǎng)基對(duì)非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)的影響

Control第26頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月碳源（碳水化合物）選用種類：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等蔗糖濃度：使用量1-5%，常用量為2－3%，幼胚培養(yǎng)可提高到4－15%蔗糖具有熱易變性，高壓滅菌后部分糖會(huì)分解。蔗糖在培養(yǎng)基中的作用：

1.為培養(yǎng)物提供能源和碳骨架

2.可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透勢(shì)第27頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Nosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%培養(yǎng)基對(duì)非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)的影響

Control第28頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月種類：主要使用B族維生素

VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、VB3（煙酸）、Vc、生物素、葉酸濃度：0.1－10.0mg/L

作用：

VB1全面促進(jìn)生長(zhǎng)，提高活力

VB6促根生長(zhǎng)

Vc抗氧化作用，防組織褐變維生素第29頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

肌醇其本身并沒(méi)有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，但在糖類的

1、促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)、胚狀體和芽的形成

2、對(duì)組織細(xì)胞繁殖、分化的促進(jìn)作用椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量10－20%，香蕉泥：對(duì)PH值緩沖大，用量150－200ml/L馬鈴薯：對(duì)PH值緩沖大，用量150－200g/L，有利壯苗水解酪蛋白：濃度100－200mg/L，應(yīng)用在微莖尖培養(yǎng)有機(jī)附加物第30頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Auxins——生長(zhǎng)素誘導(dǎo)(啟動(dòng))細(xì)胞的分裂,促進(jìn)根的形成其中2，4-D對(duì)胚性細(xì)胞團(tuán)的形成尤其有效溶于95%乙醇第31頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月NoNAANAAreducedto0.1mg.l-1

NAAincreasedto5.0mg.l-1培養(yǎng)基對(duì)非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)的影響

Control第32頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Cytokinins——細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽的分化形成溶于1mol/L的HCl

第33頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞分裂素類(cytokinin)（1）種類：6－BA

KT

ZT（2）作用：誘導(dǎo)不定芽分化和莖、苗增殖。（3）濃度：0.05－10.0mg/L①誘導(dǎo)芽的分化、促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)②促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。③抑制根的分化。細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。第34頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月NoBA

BAreducedto0.1mg.l-1

BAincreasedto5.0mg.l-1培養(yǎng)基對(duì)非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)的影響

Control第35頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月激素配比模式（P31）生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向（形成愈傷組織；長(zhǎng)根；長(zhǎng)芽）。

高有利于根的形成生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素和愈傷組織的形成

適中有利于根芽的分化

低有利于芽的形成第36頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HIGH

HIGHAUXIN

CYTOKININS

EQUALAMOUNTS

第37頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月GA(gibberellicacid)赤霉素（1）種類：分別從植物,真菌和細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)赤霉素類物質(zhì)超過(guò)140種.GA3是目前主要的商品化和農(nóng)用形式。（2）作用：促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)促進(jìn)幼苗莖、芽的伸長(zhǎng)促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。第38頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其它附加成分1.瓊脂：培養(yǎng)基凝固劑，一般用量為0.6-1.0%(用量6－10g/L).

第39頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

培養(yǎng)方式

固體培養(yǎng)

液體培養(yǎng)主要在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用，營(yíng)養(yǎng)分布均勻，生長(zhǎng)整齊一致，但通氣性差。使用普遍，加入瓊脂等凝固劑固化，通氣性較好，便于操作，但營(yíng)養(yǎng)分布不均，生長(zhǎng)發(fā)育不整齊。第40頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月固體培養(yǎng)方式的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn):1）實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求簡(jiǎn)單；2）培養(yǎng)時(shí)占用空間少；缺點(diǎn)：1）外植體只有一部分表面能接觸培養(yǎng)基，容易造成培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度差異，影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)；2）外植體插入培養(yǎng)基的部分，常因氣體交換不暢以及有毒代謝產(chǎn)物的積累而影響組織的呼吸或造成毒害；3）很難產(chǎn)生均勻一致的細(xì)胞群。第41頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）培養(yǎng)基的配制第42頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MS培養(yǎng)基特點(diǎn)：無(wú)機(jī)鹽濃度高、元素間比例適當(dāng),離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性，是目前使用最廣泛的培養(yǎng)基。無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)成分含量較低，適用于生根培養(yǎng)。White培養(yǎng)基特點(diǎn)：1、常用培養(yǎng)基特點(diǎn)第43頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月B5培養(yǎng)基特點(diǎn)：

含較高的NO3-N，氨態(tài)氮含量較低，含有較高的硫胺素（VB1）較適用于一些要求較高氮素營(yíng)養(yǎng)的植物培養(yǎng)，如常見(jiàn)木本植物雙子葉植物組培的選擇。

1、常用培養(yǎng)基特點(diǎn)第44頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月N6培養(yǎng)基特點(diǎn)：

成分簡(jiǎn)單，KNO3

和(NH4)2SO4含量高，適合花藥培養(yǎng),尤其適合禾本科植物的組織培養(yǎng)。1、常用培養(yǎng)基特點(diǎn)第45頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、培養(yǎng)基制備（1）母液配制與保存（2）培養(yǎng)基配制第46頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MurashigeandSkoog(MS)MediumMacroelementsMicroelements

(>0.5mmol/L)(<0.5mmol/L)MgSO4.7H2O0.37g/LKI0.83mg/LNH4NO3

1.65g/LH3BO36.2mg/LKNO3

1.9g/LMnSO4.4H2O22.3mg/LCaCl20.33g/LZnSO4.7H208.6mg/LKH2PO40.17g/LNa2MoO4.2H2O0.25mg/LCuSO4.5H2O0.025mg/LCoCl2.6H2O0.025mg/L

Na2.EDTA

37.3g/L

FeSO4.7H2O

27.8mg/L第47頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）母液的配制與保存培養(yǎng)基母液：在配制培養(yǎng)基前將培養(yǎng)基中常用藥品混合或單獨(dú)配制成比所需濃度高10-100倍的濃縮液。第48頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）母液的配制與保存配制母液的優(yōu)點(diǎn)：1）使用方便；2）減少多次稱量產(chǎn)生的工作量及稱量所產(chǎn)生的誤差；3）微量元素用量極小，配制成母液可保證稱量的精確性。常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物類和激素類分別配制成比培養(yǎng)基濃度高10-100倍的母液，低溫保藏。第49頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月母液的配制(以MS為例)母液配制要求：1.母液濃縮倍數(shù)：大量元素10×;微量元素10×、鐵鹽100×;有機(jī)物50－100×.2.選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化學(xué)純?cè)噭?.防止沉淀4.激素母液配制時(shí)的溶劑選擇

第50頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月混配法配制母液：配制母液時(shí)為減少工作量，增加準(zhǔn)確度，將幾種藥品配在同一母液中。通常大量元素、微量元素、有機(jī)物均可采用混配方法配成濃縮一定倍數(shù)的母液。collectingtheingredients第51頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)機(jī)鹽１L培養(yǎng)基中用量(mg)稱取量（g）定容體積KNO3190019分別溶解后混合定容至1000ml。NH4NO3165016.5MgSO4·7H2O3703.70KH2PO41701.70CaCl2·2H2O4404.40大量元素母液（擴(kuò)大10倍）注意：為避免發(fā)生沉淀，應(yīng)注意各種化合物的組合以及加入的先后順序。母液的濃度可用aml/L表示，其意義為：配制1升培養(yǎng)基吸取該母液a毫升。第52頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MurashigeandSkoog(MS）MediumMgSO4.7H2O0.37g/LKI0.83mg/LNH4NO3

1.65g/LH3BO36.2mg/LKNO3

1.9g/LMnSO4.4H2O22.3mg/LCaCl20.33g/LZnSO4.7H208.6mg/LKH2PO40.17g/LNa2MoO4.2H2O0.25mg/LCuSO4.5H2O0.025mg/L甘氨酸2mg/L

CoCl2.6H2O0.025mg/L鹽酸硫胺素（VB1）0.5mg/L鹽酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L

Na2.EDTA

37.3g/L

煙酸0.5mg/L

FeSO4.7H2O

27.8mg/L肌醇

100mg/L第53頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月鐵鹽的配法:Fe2+在培養(yǎng)基中不穩(wěn)定，故要用螯合劑Na2－EDTA來(lái)配制，配制方法如下：在裝有400ml蒸餾水的燒杯中加入2?？列遭c，溶解后加入3.73gNa2–EDTA,加熱使其全部溶解，然后邊攪拌，邊慢慢加入2.78gFeSO4·7H2O直至全部溶解,冷卻后定容至1000ml（濃度10ml/L)，倒入棕色試劑瓶中，置于冰箱中冷藏，保存?zhèn)溆玫?4頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單配法配制母液：對(duì)于激素類等針對(duì)不同培養(yǎng)物需要調(diào)節(jié)用量的物質(zhì)可配成單一化合物的母液。這種母液的濃度一般用amg/ml。其意義為：每毫升母液中含有a毫克溶質(zhì)。某種激素母液濃度為0.25mg/ml，如果要配制該激素為0.5mg/l的MS培養(yǎng)基1L，則應(yīng)吸取該激素母液

ml。

第55頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月激素母液的配制:

激素類物質(zhì)一般都難溶于水,在溶解時(shí)要借助其它溶劑使其能溶于水中.

細(xì)胞分裂素類：一般先用少量1N鹽酸溶解后,再加入溫水冷卻后定容

生長(zhǎng)素類：一般先用少量95%酒精溶解后,再加入一定量的溫水,冷卻后定容。第56頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月配制好的各種母液應(yīng)分別貼上標(biāo)簽，寫明母液名稱、配制1L培養(yǎng)時(shí)的取用量、配制日期等，置于冰箱中冷藏保存。培養(yǎng)基中的其它成分如瓊脂（7g/L)、蔗糖(3%)等無(wú)需配成母液，在培養(yǎng)基配制時(shí)直接加入。第57頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）培養(yǎng)基的配制正確的培養(yǎng)基配制順序（主要步驟）：在燒杯中加入一定量的水→依次加入各類母液→加入蔗糖并充分溶解→定容→調(diào)pH值→（加瓊脂→）分裝封囗→滅菌fillingthevesselsautoclaving

第58頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pH值

組織培養(yǎng)最適pH是多少？如果pH值過(guò)高或過(guò)低會(huì)有什么后果?如何調(diào)節(jié)？第59頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月不同植物的最適pＨ值

種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜6.0蠶豆5.5石刁柏7.0番茄、葡萄5.7桃pＨ值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同，如以硝態(tài)氮和以銨態(tài)作氮源。第60頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適pH值的要求是不同的;

一般來(lái)說(shuō)當(dāng)pH值高于6.5時(shí)，培養(yǎng)基會(huì)變硬；低于5.0時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。鐵鹽穩(wěn)定性影響酸堿數(shù)，EDTA-Fe能維持pH的穩(wěn)定性。pH值大小調(diào)整可用1.0M的NaOH和1.0M的

HCI來(lái)調(diào)整,調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆?。高溫滅菌?huì)降低pH值(約0.2—0.3個(gè)pH值)。培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)第61頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月如何配制1L的MS+30g/L蔗糖+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/L玉米素

+8g/L瓊脂培養(yǎng)基,并分裝在20個(gè)100mL三角燒瓶中?StocksolutionMS大量×10MS微量×100MS有機(jī)×

1006-BA1mg/mLNAA0.1mg/mL玉米素0.1mg/mL請(qǐng)你實(shí)踐：第62頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第63頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月錄相:植物的組織培養(yǎng)及其應(yīng)用第64頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題

1）培養(yǎng)基的各類成分可以配成母液，配制培養(yǎng)基時(shí)按比例吸取即可；2）配制大量元素?zé)o機(jī)鹽的母液時(shí)，要防止在混合各種鹽時(shí)產(chǎn)生沉淀；3）植物生長(zhǎng)物質(zhì)母液配制時(shí)要注意不同激素的溶解性質(zhì)；4）藥品的稱量和定容都要準(zhǔn)確；5）配好的培養(yǎng)基要調(diào)pH值。第65頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、環(huán)境條件

植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長(zhǎng)分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23-27℃之間進(jìn)行，一般采用25土2℃。溫度第66頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面：★一般來(lái)說(shuō)，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。在培養(yǎng)初期或愈傷組織增殖階段，一般采用黑暗/弱光條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)物分化期一般需要

強(qiáng)/較強(qiáng)光照

★光周期，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗?！锕赓|(zhì)，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。光照第67頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Lightxhormoneresponses:第68頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)濕度要保持在99%左右，環(huán)境的相對(duì)濕度一般要求70％-80％的相對(duì)濕度。濕度第69頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其它因素滲透壓培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因而影響到滲透壓的變化。通常1-2個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上就對(duì)植物生長(zhǎng)有阻礙作用，而5-6個(gè)大氣壓植物生長(zhǎng)就會(huì)完全停止，

6個(gè)大氣壓以上植物細(xì)胞就不能生存。第70頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其它因素通氣狀況氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問(wèn)題，可用附有濾氣膜的封口材料。◆固體培養(yǎng)基可加入活性炭來(lái)增加通氣度，以利于發(fā)根?！粢后w培養(yǎng)時(shí)，可考慮采取振蕩培養(yǎng)的方式，以增加通氣性。第71頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）培養(yǎng)基的篩選1、無(wú)機(jī)鹽的篩選：在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基(如MS培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基)開(kāi)始。2、有機(jī)物的篩選與使用：植物器官或組織培養(yǎng)一般不需添加復(fù)雜的有機(jī)成分；細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則往往需要附加一定量的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)才能成功。3、激素的篩選：根據(jù)培養(yǎng)目的，考慮適宜的激素配比模式。第72頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）常用的培養(yǎng)基篩選方法1、單因子試驗(yàn)：培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動(dòng)一個(gè)因子，找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。2、多因子試驗(yàn)：對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案。3、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法4、廣譜實(shí)驗(yàn)法第73頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Effectofcytokininsonadventitiousshootregenerationfrompumpkinashhypocotylsafter16weeks第74頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Responsivehypocotylafter4weeksonMSmediumsupplementedwith22.2uMBAand4.5uMTDZStevensME.etal.,PlantCellTissOrganCul.2011august.online第75頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、外植體的選擇及消毒第76頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）外植體的選擇1、取材部位：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌x擇不同的取材部位。2、器官的發(fā)育階段和生理狀態(tài)：發(fā)育階段:幼嫩組織比老的更具有較好的形態(tài)發(fā)生能力生理狀態(tài)：生長(zhǎng)開(kāi)始季節(jié)（即將進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期）3、外植體的大?。≒37表）：第77頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）外植體的消毒植物材料帶菌特點(diǎn)：組織塊越大，帶菌越多生長(zhǎng)旺盛期（夏秋季）帶菌多田間生長(zhǎng)比溫度生長(zhǎng)的帶菌多泥土中生長(zhǎng)的比空氣中生長(zhǎng)的帶菌多選材原則：在滿足實(shí)驗(yàn)條件的前提下，盡可能選擇帶菌少的材料，以減少污染的發(fā)生。第78頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.外植體的選擇常用外植物體的來(lái)源自然環(huán)境下生長(zhǎng)的植物無(wú)菌環(huán)境下生長(zhǎng)的植物溫室環(huán)境下生長(zhǎng)的植物第79頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.外植體的選擇來(lái)源：健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、發(fā)育正常大小：視培養(yǎng)目的而定部位（生理狀態(tài)及發(fā)育年齡）取材季節(jié)：生長(zhǎng)開(kāi)始的季節(jié)。（蘋果）第80頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月脫毒時(shí)，最好找出莖原基所帶葉原基的數(shù)目與生長(zhǎng)點(diǎn)（莖尖）大小的相關(guān)性，這樣在取材時(shí)就方便多了莖尖越小，脫毒效果越好，但是成活率越低，因?yàn)閷?duì)培養(yǎng)基的要求高，剝離技術(shù)要求高一般選擇1~2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn)如：莖尖外植體的大小與脫毒效果成反比第81頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月滅菌的原則：滅菌劑與外植體應(yīng)接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間以除去外植體表面的微生物，但應(yīng)盡量減少對(duì)外植體細(xì)胞的損害。1、常用消毒劑第82頁(yè)，課件共103頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、常用外植體滅菌的具體操作步驟

沖洗植物材料除去泥土等大的顆粒；切成適宜的大小;

浸入70-75％乙醇，0.5-1min；用2％NaClO溶液（加1滴表面活性劑）表面消