4-蛋白質濃度測定(考馬斯亮藍結合法)

蛋白質是細胞中最重要的含氮生物大分子之一，承擔著各種生物功能。蛋白質的定量分析是蛋白質構造分析的基礎，也是農(nóng)牧產(chǎn)品品質分析、食品營養(yǎng)價值比較、生化育種、臨床診斷等的重要手段。根據(jù)蛋白質的理化性質，提出多種蛋白質定量方法?？捡R斯亮藍G－250法是比色法與色素法相結合的復合方法，簡便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的常用方法。通過本實驗學習考馬斯亮藍G－250法測定蛋白質含量的原理，了解分光光度計的結構、原理和在比色法中的應用。實驗四、蛋白質濃度測定（考馬斯亮藍結合法）

一、實驗目的：

考馬斯亮藍G－250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌?。蛋白質含量在0～1000μg范圍內(nèi)，蛋白質一色素結合物在595nm下的吸光度與蛋白質含量成正比，故可用比色法測定。考馬斯亮藍G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1000μg／mL，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。實驗四、蛋白質濃度測定（考馬斯亮藍結合法）

二、實驗原理：（1）分析天平、臺式天平（2）具塞刻度試管

（3）吸管（4）研缽（5）漏斗（6）離心機、離心管

（7）容量瓶

（8）微量取樣器（9）分光光度計實驗四、蛋白質濃度測定（考馬斯亮藍結合法）

三、主要儀器：（1）標準蛋白質溶液稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100ml，制成100μg／ml的原液。（2）考馬斯亮藍G－250蛋白試劑稱取100mg考馬斯亮藍G－250，溶于50ml90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容到1000ml。此溶液在常溫下可放置一個月。（3）樣品液

取牛血清白蛋白（100ug／ml）溶液稀釋質一定濃度?；蛴眯迈r綠豆芽制備實驗四、蛋白質濃度測定（考馬斯亮藍結合法）

四、試劑：1．標準曲線的制作：取6支具塞試管，編號后，按下表加入試劑。

蓋上塞子，搖勻。放置2min后在595nm波長下比色測定（比色應在lh內(nèi)完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪出標準曲線。

操作項目管

號1

2

3

4

5

6標準蛋白質溶液(ml)0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0蒸餾水(ml)1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0G-250試劑(ml)各4蛋白質含量（μg）0

20

40

60

80

100實驗四、蛋白質濃度測定（考馬斯亮藍結合法）

五、操作：2．樣品中蛋白質含量的測定：實驗四、蛋白質濃度測定（考馬斯亮藍結合法）

五、操作：（1）準確稱取約200mg新鮮綠豆芽下胚軸，放入研缽中，加入5ml蒸餾水在冰浴中研成勻漿，離心（4000r／min，10min），將上清液倒入10ml容量瓶，再向殘渣中加入2ml蒸餾水，懸浮后再離心10min，合并上清液，定容至刻度。（2）另取1支具塞試管，準確加入0.5ml樣品提取液，再加入0.5ml蒸餾水，4ml考馬斯亮藍G－250試劑，充分混合，放置2min后，以標準曲線1號試管做參比，在595nm波長下比色，記錄吸光度。實驗四、蛋白質濃度測定（考馬斯亮藍結合法）

五、操作：根據(jù)所測樣品提取液的吸光度，在標準曲線上查得相應的蛋白質含量（μg），按下式計算：

樣品蛋白質含量（μg／g鮮重）＝（查得的蛋白質含量（μg）×提取液總體積（ml））／（樣品鮮重（g）×測定時取用提取液的體積（ml））3．結果處理：實驗四、蛋白質濃度測定（考馬斯亮藍結合法）

六、注意事項：比色出現(xiàn)藍色應在2min～lh內(nèi)完成。（蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合的反應十分迅速，在2min左右反應達到平衡；其結合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。因此測定時，不可放置太長時間，否則將使測定結果偏低。）1．考馬斯亮藍G－250法測定蛋白質含量的原理是什么？還有哪些蛋白質定量法？（微量凱氏（Kjeldahl）定氮法、雙縮脲法（Biuret法、紫外吸收法、Folin—酚試劑法（Lowry法）

2．制作標準曲線及測定樣品時，為什么要將各試管中溶液縱向倒轉混合？（將各試管中溶液縱向倒轉混合目的是使反應充分，并且使整個反應液均一，否則在比色測定時，結果會有較大偏差，使標準曲線的制作不標準，后續(xù)的測定結果就不可靠。）3．如何正確使用分光光度計？七、思考題：八、實驗報告：按常規(guī)。分光光度計的使用與注意事項1.接好電源線。2.啟動電源開關，儀器顯示“F7230”，預熱20分鐘（要打開比色皿盒蓋）。3.（1）設置年、月、日、時、分：按“CLEAR”鍵，儀器顯示“YEA”進入年份設置，按數(shù)字鍵，輸入對應的年份（限輸兩位數(shù)，下同），再按“MODE”輸入成功（下同）；顯示“MON”表示進入月份設置；顯示“DA”表示進入日期設置；顯示“HOU”表示進入小時設置；顯示“MIN”表示進入分鐘設置。最終儀器顯示當時的時間。3.（2）不設置年、月、日、時、分：按“CLEAR”鍵，儀器顯示“YEA”，直接按“0%t”鍵，儀器顯示“00-00”，表示儀器進入計時狀態(tài)，時間從88年1月1日0時0分開始。4.按“MODE”鍵，儀器顯示“T”，即可進入測定。分光光度計的使用與注意事項5.調(diào)節(jié)波長旋紐使波長移到所需之處。6.四個比色皿，其中一個放入?yún)⒈仍嚇樱ㄑb量要合適），其余三個放入待測試樣。將比色皿放入樣品池內(nèi)的比色皿架中，夾子夾緊蓋上樣品池蓋。7.將參比式樣推入光路（注意聽‘咔嚓’聲），按“100%t”鍵，至顯示“T100.0”（調(diào)100）。8.打開樣品池蓋，按“0%t”鍵，儀器顯示“T0.0”（調(diào)零）