第二章 基因工程的工具酶

第1頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

一.限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)HamiltonO.Smith1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII。1978年獲得諾獎(jiǎng)。此前（20世紀(jì)50年代），研究人員在噬菌體感染大腸桿菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了寄主細(xì)胞的限制和修飾現(xiàn)象（R/M體系）。第2頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二.寄主的限制和修飾現(xiàn)象第3頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

限制(Restriction)：指一定類(lèi)型的細(xì)菌可以通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。限制作用:實(shí)際就是限制性?xún)?nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。第4頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過(guò)甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾,從而免遭自身限制性酶的破壞。修飾作用:宿主細(xì)胞通過(guò)甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。第5頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1）

菌株中有三個(gè)連鎖的基因位點(diǎn)：hsdR、hsdM、hsdS。2）

hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶---識(shí)別DNA分子特定位點(diǎn)，將雙鏈DNA切斷。

（DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞：受體細(xì)胞去掉hsdR基因位點(diǎn)）3）

hsdM編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位點(diǎn)的堿基甲基化反應(yīng)。4）

hsdS表達(dá)產(chǎn)物的功能是---協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。

三.限制和修飾作用的分子機(jī)制第6頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第7頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四.限制性核酸內(nèi)切酶的概念和命名

概念：一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸水解酶。

命名：1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出了命名原則，1980年Roberts在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了系統(tǒng)分類(lèi)：★用具有某種限制性酶有機(jī)體的屬名第一個(gè)字母(大寫(xiě))和種名的前兩字母(小寫(xiě))組成3個(gè)字母的略語(yǔ)作為該酶的基本名稱(chēng)?！锶绻甘谴嬖谟谔厥獾木曛?，還應(yīng)在第3個(gè)字母后面標(biāo)注菌株名稱(chēng)的符號(hào)株或型(strain)

。★如果一種特殊的菌株具有幾個(gè)不同的限制與修飾體系，則以羅馬數(shù)字表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。第8頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Hind

III屬名種名

株名

發(fā)現(xiàn)順序Hin

d

III嗜血流感桿菌（Haemophilusinfluenzae

）

d株所發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶。EcoRⅠ來(lái)自于EscherichiacoliRY13的第一個(gè)限制酶。舉例+讀法第9頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五.限制性?xún)?nèi)切酶的種類(lèi)識(shí)別序列切割序列限制酶的作用模型識(shí)別序列：是一段特殊的DNA序列，該序列與其對(duì)應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶結(jié)合，是該酶切割DNA的前提。切割序列：識(shí)別完成后，限制性?xún)?nèi)切酶實(shí)施切割作用所在的DNA序列。第10頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ⅰ型酶:1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。特征：分子量較大，反應(yīng)需Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類(lèi)酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。

由于切割的隨機(jī)性，不能得到目的片段。第11頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ⅲ型酶:這類(lèi)酶可識(shí)別特定堿基序列，并在這識(shí)別位點(diǎn)下游的3’端24~26bp處切開(kāi)DNA，所以它的切割位點(diǎn)也是沒(méi)有特異性的。

Ⅱ型酶（重點(diǎn)）★1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血d株中分離出來(lái)的限制酶?！锓肿恿客ǔ］^小，只有一種多肽，以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg2+的存在?！锾攸c(diǎn)：（1）識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)上。（2）許多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。第12頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ⅲ型酶:這類(lèi)酶可識(shí)別特定堿基序列，并在這識(shí)別位點(diǎn)下游的3’端24~26bp處切開(kāi)DNA，所以它的切割位點(diǎn)也是沒(méi)有特異性的。

Ⅱ型酶（下節(jié)重點(diǎn)）

第13頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征絕大多數(shù)II型限制性?xún)?nèi)切酶都能識(shí)別由4-6個(gè)核苷酸組成的特定序列。6.1每一種酶都有各自的特異識(shí)別序列限制性?xún)?nèi)切酶是在DNA分子雙鏈的識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子，因此識(shí)別序列又稱(chēng)為該限制性?xún)?nèi)切酶靶序列。

EcoRI:GAATTCBamHI:GGATCCPstI:CTGCAGSmaI:GGGCCC第14頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征限制性?xún)?nèi)切酶II的識(shí)別序列具有雙重（180度）旋轉(zhuǎn)的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，也就是說(shuō)識(shí)別序列的核苷酸對(duì)是呈回文結(jié)構(gòu)。AGCGCTTCGCGAACNGTTGNCA第15頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征習(xí)題：下列序列中哪些可能是II類(lèi)限制酶的識(shí)別序列？

A：ATATCGB：CCCGGGC：GATATCD：AGCCGA2個(gè)方法：對(duì)折or寫(xiě)出互補(bǔ)鏈第16頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.2限制酶的切割方式平末端的DNA片段5`端具有粘性末端的DNA片段3`端具有粘性末端的DNA片段切割位點(diǎn)位于識(shí)別序列的對(duì)稱(chēng)軸上，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷，不易重新環(huán)化。切割位點(diǎn)位于對(duì)稱(chēng)軸的兩側(cè)，產(chǎn)生突出末端，在適當(dāng)溫度下，產(chǎn)生的末端可以退火互補(bǔ)，重新連接。CCCGGGGGGCCC5’5’CCC

GGGGGG

CCC5’5’SmaI第17頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.2限制酶的切割方式第18頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月識(shí)別序列切割位點(diǎn)粘性末端第19頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點(diǎn)識(shí)別序列不同，切割方式也不同。EcoRI酶切產(chǎn)生的5’粘性末端;PstI酶切產(chǎn)生的3’粘性末端；Pvull酶切產(chǎn)生的平頭末端；第20頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點(diǎn)識(shí)別序列不同，切割方式也不同第21頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第22頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第23頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點(diǎn)識(shí)別序列不同，產(chǎn)生相同的粘性末端——同尾酶。一些限制性?xún)?nèi)切酶，它們雖然來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，稱(chēng)之為同尾酶。由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生出的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，稱(chēng)之為雜種位點(diǎn)(hybridsite)。實(shí)例（百度文庫(kù)——自學(xué)）：1.利用三引物PCR和同尾酶連接的策略實(shí)現(xiàn)多基因片段的重組。2.同尾酶技術(shù)在構(gòu)建瘧疾多價(jià)重組DNA疫苗中的應(yīng)用。

第24頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雜種位點(diǎn)（hybridsite）：由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。

一般不能被原來(lái)的任何一種同尾酶識(shí)別。BamHⅠ

GGATCC

BclⅠ

TGATCA

CCTAGG

ACTAGT

雜種位點(diǎn)

TGATCC

A

CTAG

GSau3AⅠ第25頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第26頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點(diǎn)識(shí)別簡(jiǎn)并序列

簡(jiǎn)并序列是指序列中有的核苷酸位點(diǎn)可以是不同的核苷酸。例如：GTYRACY=C或TR=G或A

HindⅡ?qū)嶋H上可以識(shí)別4個(gè)特定序列。

第27頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點(diǎn)

識(shí)別序列相同，切割位點(diǎn)不同——同位酶。一些限制性?xún)?nèi)切酶，具有相同的識(shí)別位點(diǎn)，但切割部位不同，這類(lèi)酶稱(chēng)為同位酶。SmaⅠCCCGGGCCCGGGXmaⅠ雙酶切&酶的價(jià)格第28頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一些來(lái)源不同的限制性?xún)?nèi)切酶，具有相同的識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)，這類(lèi)酶稱(chēng)為同裂酶。如：HpaII/MspI。

CCGGHpaII不能切割MspI能夠切割C*CGGC*CGG表示甲基化6.3限制酶的切割特點(diǎn)六.Ⅱ型限制酶的基本特征第29頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ⅱ型限制性?xún)?nèi)切酶不具甲基化功能。Ⅰ、Ⅲ型限制性?xún)?nèi)切酶本身具有甲基化酶的功能。Ⅱ型限制性?xún)?nèi)切酶甲基化：由相應(yīng)的甲基化酶承擔(dān)。6.3限制酶的切割特點(diǎn)GAATTCCTTAAGEcoRⅠ甲基化酶AAEcoRⅠ六.Ⅱ型限制酶的基本特征第30頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月七.Ⅱ型限制酶的主要用途①在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構(gòu)建基因文庫(kù)。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。⑤改建質(zhì)粒。第31頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月八.酶切反應(yīng)的操作◆大部分II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似反應(yīng)條件：

Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/L

NaCl0-100mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μL

Temperature37℃Time1-1.5h◆1個(gè)單位限制性核酸內(nèi)切酶：在建議使用的緩沖液及溫度下，在20μL反應(yīng)液中反應(yīng)1h，使1μg標(biāo)準(zhǔn)DNA完全消化所需的酶量。bufferHMKL？？？第32頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月＋－電泳紫外分析37℃1h加反應(yīng)液CKMBuffer(10X)2.0L（總體積決定）Water16.5L（可變）DNA1.0Lor1.0

g（可變）Enzyme0.5-1.0LVolume20.0L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT八.酶切反應(yīng)的操作第33頁(yè)，課件共37頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切。對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解。低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切。一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切。0.1倍體積的5MNaAcpH5.4；2.5倍體積的冰冷乙醇；冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥；九.聯(lián)合酶解（雙酶切）沉淀DNA的方