細胞培養(yǎng)的個人體會

細胞培養(yǎng)的個人體會第1頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月如何做好實驗？

“播下一種習慣，你將收獲一種性格；播下一種性格，你將收獲一種命運”。

威廉.詹姆士個人體會：題外話：

1、“養(yǎng)成良好的實驗習慣”。實驗前：查資料，計劃好，充分準備。實驗中：認真操作，關鍵點作好記錄。（可寫在草稿本上）。實驗后：整理實驗物品，用過的東西要放回原位，及時清理垃圾，抽空根據(jù)草稿本詳細寫下實驗記錄。（寫在實驗記錄本上）

實驗其間，聽從老師和師兄、師姐的安排和管理！第2頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、“養(yǎng)成獨立思考、獨立解決問題的習慣”全面提高自己的能力，力求能獨擋一面。遇到問題，首先自己想辦法去解決。3、“養(yǎng)成良好的心態(tài)”“雄心”:有抱負和理想，做好文章?！昂阈摹保簣猿帧！捌匠Ｐ摹保簭娜莸?，慢而不拖，快而不亂.4、“苦干+巧干”

苦干：多練習，熟能生巧?！白觥鼻筛桑憾嗫偨Y，掌握規(guī)律。“思”

第3頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月內容提要1.細胞培養(yǎng)簡介2.細胞的復蘇和凍存細胞的復蘇細胞的凍存3.細胞的換液與傳代個人方法無菌操作技術細胞計數(shù)和接種第4頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月體外培養(yǎng)（in

vitro

culture）：是將活體成分或其寄生體內取出，放在類似于體內生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法?？煞譃槠鞴倥囵B(yǎng)、組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)三種類型。細胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)第5頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月簡化環(huán)境因素、排除了體內實驗時一些復雜的因素的影響，利于應用各種物理、化學和生物等外界因素探索和提示細胞生命活動的規(guī)律；提供了大量生物性狀相同的細胞，特別是人的活細胞材料作為研究對象。經濟、便利，解決了不能用人做實驗的問題。缺點是無法模擬體內的情況，結果有局限性。細胞培養(yǎng)的特點第6頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月CO2培養(yǎng)箱細胞培養(yǎng)基本設備定期清潔，換水。拿出細胞及時關好門，保持CO2濃度。短時不用，將光源調至最小，避免反復開關。長時不用，及時關電源。使用注意問題：倒置顯微鏡第7頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月超凈工作臺使用前紫外照20-30分鐘。使用時別忘關紫外，防止灼傷。定期換水，保持干凈的水。使用前檢查水位，不足補充純水。最好細胞培養(yǎng)專用一個滅菌鍋。使用注意問題：高壓滅菌鍋第8頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)管、細胞培養(yǎng)板、藍蓋瓶、吸管；離心管、細胞凍存管、1ml、5mlEP管；血細胞計數(shù)器；恒溫磁力攪拌器、恒溫水浴振蕩器；刀、剪、鑷解剖用具，200目不銹鋼網；細胞培養(yǎng)的基本用品第9頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎上，添加了氨基酸、維生素和與血清中濃度相似的營養(yǎng)物質。選擇培養(yǎng)基很重要，不同細胞需要適合的培養(yǎng)基。常見的培養(yǎng)基有：DMEM、F12、DMEM/F12、1640等。

基礎培養(yǎng)基第11頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月一般是從牛的血液中提取，含有豐富的營養(yǎng)養(yǎng)物質。常用的胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS),使用前分裝50ml離心管，-20℃保存。注意解凍分裝前請混合均勻。

使用時放在4℃冰箱解凍，需1-2天。血清第12頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月血清和基礎培養(yǎng)基按一定比例混合，一般配制含10-15%血清的培養(yǎng)基，用于細胞培養(yǎng)。如取20ml胎牛血清，同時加入180mlDMEM基礎培養(yǎng)基，即可配成200ml含10%胎牛的DMEM.完全培養(yǎng)基第13頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月器皿加洗潔精浸泡數(shù)小時后，用自來水沖洗9次，然后蒸餾水沖洗3次。烘干：洗干凈后烘干。包裝：用牛皮紙或布包裝。消毒前貼上滅菌條，條上寫明日期、物品、所有者。

可重復利用物品的清洗和滅菌第14頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月高壓滅菌：包裝好的器皿裝入高壓鍋內，121℃，維持30分鐘。

滅菌后烘干：高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，要放入烤箱內烘干備用。注意：泡酸（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時。（玻璃器皿第一次洗需要用，以后可以省這一步）。第15頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞的復蘇和凍存

第16頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞復蘇與凍存的原則是“慢凍速融”。復蘇細胞時，速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5℃～0℃。凍存細胞時，向培養(yǎng)基中加入保護劑二甲基亞砜（DMSO），可使冰點降低，在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，減少細胞冰晶的形成。復蘇與凍存的原則第17頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、準備好37℃水浴燒杯。2、將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入37～40℃水浴中使其在1min內融化。3、無菌條件下打開凍存管，取細胞懸液至離心管中，補加5mL培養(yǎng)液，1600rpm低速離心5min。4、去上清，加入新鮮培養(yǎng)液適量，吹打成細胞懸液，轉入培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)。復蘇的標準方法第18頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月復蘇前，準備好含有5mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，放入37℃培養(yǎng)箱。1、準備好40℃水浴燒杯。2、將凍存于液氮中的凍存管取出，還原保存盒放入液氮中。將取出凍存管迅速放入水浴中，迅速搖晃加速其融化，放在水浴中，5min鐘內須完成。3、將凍存管放入15mL離心管（剪去底部的舊離心管）中，1500rpm，離心3min。4、從離心管中取出凍存管，小心吸去上清，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，加入37℃的培養(yǎng)液1mL，吹打30次，轉入培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)。個人方法第19頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月1、胰酶消化，加含血清培養(yǎng)基終止，離心。2、去上清，加入凍存液1.5mL，吹打60次，轉入凍存管。3、凍存管放入4℃30分鐘--->-20℃60分鐘

--->-80℃16-18小時(或隔夜)--->投入液氮中。3、或凍存管置于程序降溫盒中，放置-80℃，--->投入液氮中。凍存的個人方法：附：凍存液個人配方：培養(yǎng)基：血清：DMSO普通細胞可用：7份：2份：1份細胞脆弱可用：5份：4.2份：0.8份第20頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞的換液和傳代第21頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月貼壁期:0.5-4h潛伏期:5-24h對數(shù)生長期:24-96h停止期（衰老期）:96h以上貼壁生長細胞的生長過程新鮮培養(yǎng)基對數(shù)期停止期（紅）（淡紅略黃）（黃）第22頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月貼壁生長細胞的換液全換液：完全吸除瓶內舊培養(yǎng)液，向瓶內加入約4-6mL培養(yǎng)液。置37℃培養(yǎng)，適合于普通細胞。半換液：吸除瓶內一半的舊培養(yǎng)液，向瓶內補加入約3mL培養(yǎng)液。置37℃培養(yǎng)。適合于生長較慢的細胞。當細胞沒有滿細胞培養(yǎng)瓶時，而培養(yǎng)基顏色變成略黃狀態(tài)時，說明營養(yǎng)消耗不少，環(huán)境酸性較強，為減少其對細胞損傷，須對細胞補充新鮮培養(yǎng)基。死細胞較多時，需要除掉死細胞。換液時機：換液方法：第23頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月

細胞鋪滿瓶底80%，吸除瓶內舊培養(yǎng)液，向瓶內加入少量約1～2mL消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面；在37℃環(huán)境下孵育1-2min，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大。加入含血清培養(yǎng)基，終止消化，用彎頭吸管吸取瓶內培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，使之脫落，吹打成細胞懸液。轉入離心管，1000-2000rpm，離心5min。去上清，加入新鮮培養(yǎng)液適量，吹打成細胞懸液，以1：2或1：3的比例接種在新的培養(yǎng)瓶內，置37℃培養(yǎng)。傳代的標準方法第24頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月

細胞鋪滿瓶底約80%，吸除舊培養(yǎng)液，向瓶內加入600uL胰酶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍細胞表面；吸除胰酶，在培養(yǎng)箱中孵育1-2min，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大。加入新鮮培養(yǎng)液2mL，吹打成細胞懸液，以1：2或1：3的比例接種在新的培養(yǎng)瓶內（已預加新鮮培養(yǎng)基3ml)，置37℃培養(yǎng)。

(比標準方法省2步)傳代的個人方法(消化+機械吹打）第25頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月細節(jié)決定成敗，要注意的細節(jié)很多。詳細的內容可參考“細胞培養(yǎng)無菌技術”PPT、視頻。

無菌操作技術（關鍵技術）個人體會：特別注意Vulnerableareas，吸管吸取液體時盡量不接觸瓶口。盡量避免在培養(yǎng)皿和所有瓶口的上方操作。同一根吸管不應連續(xù)用于兩個不同的液體或細胞系。只要吸管接觸瓶外面任何地方都要丟棄，換新管。第26頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月常見細胞污染A:正常B:桿狀細菌污染C:球狀細菌污染D:絲狀真菌污染E:酵母污染第27頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月1號區(qū)5號區(qū)細胞計數(shù)1、使用計數(shù)板人工計數(shù)2、使用自動細胞計數(shù)儀電腦計數(shù)第28頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞密度=(1+2+3+4)/4萬個細胞每毫升13422第29頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月合適細胞密度是實驗成功關鍵第30頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月合適的細胞培養(yǎng)液體積第31頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月常用細胞接種密度計算常見問題：現(xiàn)有4ml細胞懸液，細胞計數(shù)的結果為110萬個/ml，現(xiàn)在要接種到96孔板中，若每孔2萬個細胞，請問如何配制實驗所需的細胞懸液?傳統(tǒng)算法：本來是96孔，實際要多預留一些，若多算10孔的話，共106孔。1、所需總細胞數(shù)：2萬X106=212萬2、所需總體積：100ulX106=10.6ml就是說要把212萬個細胞放入總體積10.6ml培養(yǎng)基中。需要取212萬除以110萬個/ml=1.93ml細胞懸液，補加10.6-