細(xì)胞工程第十一章動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用技術(shù)

細(xì)胞工程第十一章動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用技術(shù)第1頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)在單克隆抗體制備中的應(yīng)用1975年kohler和milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的單克隆抗體獲得1984年諾貝爾獎。單克隆抗體概念：每一克隆B細(xì)胞所產(chǎn)生的理化性狀高度均一、組成均一、只與同一種抗原決定族反應(yīng)的抗體，稱為單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）。第2頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月一、雜交瘤技術(shù)的基本原理和過程（一）細(xì)胞的選擇與融合（二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用（三）有限稀釋與抗原特異性選擇第3頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月二、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的基本過程及方法第4頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月二、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體流程動物免疫分離脾細(xì)胞制備骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞陽性孔克隆化并擴(kuò)大培養(yǎng)再次克隆克隆擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)收集上清液動物接種收集腹水單克隆抗體純化保存ELISA測血清第5頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月三、單克隆抗體的基本技術(shù)1.抗原提純與動物免疫：抗原純度高：電泳純與骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c小鼠2.細(xì)胞的選擇：

A經(jīng)過抗原免疫的B細(xì)胞（脾細(xì)胞）。

B腫瘤細(xì)胞(多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞:Sp2/0）。3.細(xì)胞融合：融合劑：聚乙二醇

(PEG,常用聚合度1000~2000濃度w/v：40%)

細(xì)胞比例：1:2~1:10，常用1:4。反應(yīng)時間：2~4min。第6頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月4.培養(yǎng)基的選擇：HAT培養(yǎng)基。含有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).5.細(xì)胞的DNA合成一般有兩條途徑：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與反應(yīng)。B：在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。第7頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月6.HAT培養(yǎng)基的選擇原理：⑴氨甲蝶呤(A)是葉酸拮抗劑，可阻斷細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，細(xì)胞在含有氨甲蝶呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DNA。⑵瘤細(xì)胞是HGPRT酶陰性細(xì)胞，自身不能通過替代途徑合成DNA而繁殖。⑶B細(xì)胞雖含有HGPRT，但不能在體外培養(yǎng)存活（只存活5~7d，且功能下降)。⑷融合細(xì)胞含有B細(xì)胞和瘤細(xì)胞，其中瘤細(xì)胞核利用B細(xì)胞的HGPRT酶進(jìn)行旁路合成DNA而存活。第8頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月7.克隆化并擴(kuò)大培養(yǎng)(單細(xì)胞培養(yǎng)稱為克隆化)：⑴有限稀釋法:將細(xì)胞懸液逐次稀釋后加入培養(yǎng)孔(36%的孔為1個細(xì)胞/孔)，可獲得單個細(xì)胞形成的克隆，選擇高分泌抗體的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。⑵顯微操作法：在倒置顯微鏡下吸出單個細(xì)胞培養(yǎng)。⑶軟瓊脂平板法：下飼養(yǎng)/上融合C,分層培養(yǎng)后用⑵法⑷細(xì)胞分選儀法：流式細(xì)胞儀分選。8.單克隆抗體的制備、純化：A體外細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，取上清液提純。B接種小鼠腹腔，取腹水提純。C純化按抗體純化步驟進(jìn)行。9.細(xì)胞株凍存和復(fù)蘇：加小牛血清或1640培養(yǎng)液配成終濃度10%的二甲亞砜(DMSO)凍存液后液氮(-196℃)保存。原則是：慢凍(逐步降溫，以每分鐘降1℃為宜)，快融(立即浸入37~40℃水浴)。第9頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月10.注意事項：⑴用降植烷(pristane)等油類制劑，反復(fù)注入BALB/C小鼠腹強腔，可誘發(fā)產(chǎn)生小鼠骨髓瘤細(xì)胞。這種細(xì)胞在適宜培養(yǎng)條件下，具有無限繁殖能力，選擇本身不會產(chǎn)生Ig(SP2/O和小鼠骨髓瘤653細(xì)胞株)的對數(shù)期生長細(xì)胞作為融合細(xì)胞。⑵選擇缺乏HGPRT或TK的細(xì)胞：

A采用毒性藥物8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine,8-AG)選育出缺乏HGPRT的細(xì)胞(因為缺乏HGPRT+細(xì)胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT+細(xì)胞才能存活），培養(yǎng)過程中有個別細(xì)胞出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，故應(yīng)定期用15~20ug/ml的8-AG處理細(xì)胞。第10頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月B或利用5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BudR)誘發(fā)缺乏TK的細(xì)胞。一般選育缺乏TK的細(xì)胞較困難。⑶采用飼養(yǎng)細(xì)胞：在體外培養(yǎng)條件下，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易順利生長繁殖。當(dāng)加入一定量的其他活細(xì)胞后，?？纱龠M(jìn)原有細(xì)胞的繁殖，這種加入的細(xì)胞即稱為飼養(yǎng)細(xì)胞，可用普通小鼠脾細(xì)胞/腹腔細(xì)胞/胸腺細(xì)胞、大鼠和豚鼠的腹腔細(xì)胞，最常用普通小鼠腹腔細(xì)胞。第11頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月三、典型制備單克隆抗體具體步驟（一）細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)（二）細(xì)胞融合試驗（三）單克隆抗體檢測（四）克隆化培養(yǎng)（五）雜交瘤細(xì)胞的鑒定（六）單克隆抗體的制備（七）單克隆抗體的鑒定（八）單克隆抗體的純化第12頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月四、單克隆抗體的應(yīng)用1.診斷(檢測)試劑：病原體、腫瘤標(biāo)志物、細(xì)胞表面標(biāo)志等2.治療：A移植物受者使用T細(xì)胞的McAb，可預(yù)防急性排斥反應(yīng)。B供體骨髓在體外經(jīng)T細(xì)胞的McAb處理，可減輕或消除移植物抗宿主反應(yīng)。CAIDS治療D腫瘤介入治療：細(xì)胞毒劑(藥物)與抗腫瘤抗原的McAb結(jié)合后，利用McAb的導(dǎo)向作用，將細(xì)胞毒劑(藥物)定位于腫瘤細(xì)胞，到達(dá)直接殺死腫瘤細(xì)胞的目的。第13頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)外源基因在動物細(xì)胞中的表達(dá)一、基本原理&基本技術(shù)宿主載體原件轉(zhuǎn)導(dǎo)第14頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月通俗地說，就是按照人們的意愿，把一種生物的個別基因復(fù)制出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向改造生物的遺傳性狀。第15頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月基因重組與基因工程

(geneticrecombination

andgeneticengineering)第17頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月基因重組

是指在體外用酶學(xué)方法將不同來源的DNA進(jìn)行切割、連接，組成一個新的DNA分子的過程，又稱DNA重組。基因克隆

將重組DNA分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其擴(kuò)增和繁殖，以獲得大量的同一DNA分子，稱此為基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程

實現(xiàn)基因克隆所采用的方法和相關(guān)工作，統(tǒng)稱為重組DNA技術(shù)或基因工程。第18頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

本章主要內(nèi)容重要的工具酶基因克隆常用的載體重組DNA基本原理重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用第19頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)重要的工具酶工具酶

基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。第20頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月一、限制性核酸內(nèi)切酶(RE)是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并水解該點磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或切割酶。

根據(jù)限制酶的作用特性，一般分為三類：

——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

第21頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

限制酶（Ⅱ型）識別及切割位點特異識別及切割48個bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產(chǎn)生3種缺口：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或鈍端

回文序列是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉(zhuǎn)對稱;

粘性末端是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的堿基序列相互具有互補性。第22頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月⑴產(chǎn)生5'-粘性末端

⑵產(chǎn)生3'-粘性末端第23頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月⑶產(chǎn)生平(頭末)端/鈍端其它特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制酶同裂酶（異源同工酶）同尾酶可變酶第24頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月同裂酶

又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識別序列。在切割DNA時，其切割點可以是相同的，產(chǎn)生平頭末端，稱為同識同切；切割點也可以是不同的，產(chǎn)生3ˊ或5ˊ粘性末端，稱為同識異切。第25頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月同裂酶——同識同切第26頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月同裂酶——同識異切第27頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月同尾酶

同尾酶

指來源不同，但識別與切割順序有一定的相關(guān)性的一類酶。它們作用后產(chǎn)生相同的粘性末端。第28頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月可變酶可變酶

識別順序中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別順序往往超過6個堿基對。如，BstpⅠ，其識別順序為GGTNACC。第29頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

常用限制性核酸內(nèi)切酶的特性微生物名稱酶名稱識別順序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢桿菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢桿菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大腸桿菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普羅威登細(xì)菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色鏈球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ第30頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月二、DNA聚合酶

（最常用的DNA聚合酶有以下4種）

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段

TaqDNA聚合酶

T4噬菌體DNA聚合酶第31頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月㈠DNA聚合酶Ⅰ

E.Coli

DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一個具有3種酶活性的多功能性酶。包括：

5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性

5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性

3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性第32頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNApolⅠ應(yīng)用⑴催化DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性DNA

探針；⑵第二條cDNA鏈的合成；⑶對DNA3’突出末端進(jìn)行標(biāo)記；⑷DNA序列分析。第33頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移第34頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月㈡Klenow片段（DNApol.大片斷）第35頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

Klenow片段用途⑴補齊雙鏈DNA的

3ˊ末端；⑵用標(biāo)記堿基補齊3ˊ末端；

⑶在cDNA克隆中，用于第二股鏈的合成；⑷DNA序列分析。第36頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

㈢TaqDNApol（耐熱DNA聚合酶）

作用特點1）TaqDNApol催化DNA合成的最適溫度范圍

7075℃，2）95℃以上高溫，半小時不失活，3）最適合用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。第37頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月三、逆轉(zhuǎn)錄酶

特點

逆轉(zhuǎn)錄酶是一個多功能性酶，至少具有以下3種酶活性：⑴以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的

RNA⑶以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。第38頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用：⑴將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫；⑵補平和標(biāo)記5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制備雜交探針等。第39頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月四、DNA連接酶(DNAligase)

DNA連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3ˊ－OH與另一條鏈的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構(gòu)成一條完整的DNA長鏈。

DNA連接酶的用途（1）兩個雙鏈DNA片段連接起來5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA連接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修補帶有缺口的雙鏈DNA分子T4DNA連接酶第40頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月五、堿性磷酸酶

堿性磷酸酶(BAP)能夠催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基團(tuán)。用途⒈制備載體時，用堿性磷酸酶處理去除載體分子5ˊ－端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。⒉用32P標(biāo)記5'-端前，去除5'-P，再通過激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端進(jìn)行標(biāo)記。第41頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月六、末端（脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶(TdT)

作用

將標(biāo)記或未標(biāo)記的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化載體分子或待克隆的DNA片斷上加上互補的同聚尾，便于進(jìn)一步連接。應(yīng)用①探針標(biāo)記

P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32

②在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接第42頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月重要的工具酶工具酶活性限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNAT4DNA連接酶催化DNA5ˊ-磷酸與3ˊ-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA堿性磷酸酶切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化3'-端合成同聚體尾第43頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)基因克隆常用的載體載體(vector)

是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主細(xì)胞的運載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA。

本節(jié)主要內(nèi)容載體必須具備的基本條件載體的種類常用的載體第44頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月一、載體必須具備的基本條件⒈有自身的復(fù)制子，能獨立復(fù)制⒉具備多個限制酶的識別位點(多克隆位點)⒊具有遺傳表型或篩選標(biāo)記⒋有足夠的容量以容納外源DNA片段。⒌表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子、前導(dǎo)序列、增強子等調(diào)控元件。⒍載體DNA中均有一段非必需區(qū)，將外源基因插入該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。第45頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月二、載體的種類*（一）克隆載體

用來克隆和擴(kuò)增DNA片段的載體，具有3點共性：⑴能夠在受體細(xì)胞復(fù)制；⑵帶有藥物抗性基因，便于篩選；⑶可導(dǎo)入受體細(xì)胞。（二）表達(dá)載體除具有克隆載體所具有的性質(zhì)外，還帶有表達(dá)構(gòu)件——轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的DNA順序。第46頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月三、常用的載體

（一）質(zhì)粒(plasmid)：

是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點：

1.分子量相對較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)，有較高的拷貝數(shù)

2.具有1個以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選

3.具有多克隆位點

第47頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量較小、高拷貝的“松弛型”質(zhì)粒，且具有一個以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點的質(zhì)粒。廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒：

pBR32質(zhì)粒、pUC系列等第48頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

pBR322質(zhì)粒①4363bp②含一個復(fù)制點含一個抗氨卞青霉素標(biāo)記(ampR)④一個抗四環(huán)素標(biāo)記(tetR)⑤ampR和tetR基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點，供外源基因插入當(dāng)外原基因插入抗藥基因位點時，AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).第49頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC系列質(zhì)粒

由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；（1）2674bp；（2）有ampr和與M13噬菌體相同的多克隆位點（MCS）（3）有一個來自大腸桿菌的LacZ操縱子的DNA片斷,編碼半乳糖苷酶第50頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)λ噬菌體組成特點：雙鏈線狀DNA分子，全長50kb，含65個基因，在其分子兩端各含有12個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點。第51頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

λ噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性生長和溶源性生長

溶菌性生長（lyticpathway）噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2個COS位點互補成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。

溶源性生長(lysogenicpathway)

噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解。第52頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖）第53頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

第三節(jié)重組DNA基本原理（DNA重組基本程序包括下列過程）

分—獲取目的基因和載體接—目的基因與載體的連接轉(zhuǎn)—重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩—重組DNA的篩選與鑒定第54頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月1、獲取

DNA重組基本過程第55頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月2、重組第56頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月3、轉(zhuǎn)化第57頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月4、篩選第58頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月5、克隆第59頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月6、表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物分離純化第60頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月一、目的基因的獲取（分）目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因，也是需要克隆或表達(dá)的基因。

目的基因來源

1）制備基因組DNA2）制備cDNA3）聚合酶鏈反應(yīng)

4）人工合成基因第61頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）制備基因組DNA（基因文庫）分離、純化基因組DNA

條件：溫和，在EDTA或SDS等存在下

↓RE用蛋白酶K消化細(xì)胞、酚抽提大小不同酶切片段

片段分離：常用蔗糖梯度或電泳分離

↓分別與同樣RE消化的載體連接常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體

↓DNA連接酶連接。

導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增。

↓

篩選鑒定用分子雜交、凝膠電泳等方法鑒定。第62頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）制備cDNA

（cDNA文庫）（1）合成cDNA第一條鏈反應(yīng)體系只有mRNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、4種dNTP、引物。引物是與mRNA3ˊ端polyA互補的寡聚dT（12～18dT片段）（2）合成cDNA第二條鏈RNase去掉模板mRNA（3）構(gòu)建cDNA文庫①cDNA兩端加接頭或銜接頭接頭是人工合成的雙鏈寡核苷酸兩端平頭，含有限制酶切位點。銜接頭是另一種人工合成的雙鏈寡核苷酸一端平頭，另一端為粘性末端。②cDNA與載體相連。③導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆，這些菌體內(nèi)保存cDNA集合體便是cDNA文庫。第63頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）制備cDNA（cDNA文庫）

分離目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA單鏈水解去除mRNA，合成cDNA雙鏈水解回折處單鏈得到平端雙鏈cDNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆,構(gòu)建cDNA文庫第64頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等條件下，體外經(jīng)94℃變性、54℃退火及72℃延伸3個步驟的反復(fù)多次循環(huán)（2530次），擴(kuò)增目的基因（見18章）。

（四）人工合成基因

引用DNA測序儀測出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸組成反推核苷酸序列，再用DNA合成儀通過化學(xué)合成原理合成目的基因。

一般先合成短片斷DNA，然后再拼接成長片段。第65頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月二、目的基因與載體的連接（接）

（主要有以下4種連接方式）1)粘性末端連接2）平頭末端連接3）人工接頭法4）同源多聚尾連接法第66頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

（一）粘性末端連接

將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再通過DNA連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組DNA分子。

（二）平頭末端連接

某些限制酶只能將目的基因和載體DNA切割成平端，此時在T4DNA連接酶的作用下同樣能連接起來。第67頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）人工接頭法合成連接子→與DNA平頭末端連接→限制酶切割,產(chǎn)生粘性末端→連接，構(gòu)建重組DNA。第68頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）同源多聚尾連接法第69頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)）

無性繁殖

體外重組后的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，形成轉(zhuǎn)化子。然后隨受體細(xì)胞生長、增殖，使重組DNA發(fā)生復(fù)制、擴(kuò)增，這一過程稱為無性繁殖。克隆

從上述無性繁殖細(xì)胞中進(jìn)一步篩選出含目的DNA的重組體分子即為無性繁殖系或克隆。宿主細(xì)胞

進(jìn)行無性繁殖時所采用的受體細(xì)胞.第70頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)化以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；轉(zhuǎn)染以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；轉(zhuǎn)導(dǎo)以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。

感受態(tài)細(xì)胞

用特殊方法處理后，受體細(xì)胞才具備接受外源DNA的能力，這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。第71頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月四、重組DNA的篩選與鑒定（篩）（篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法）

1）平板篩選2）限制酶切圖譜篩選3）PCR篩選重組體4）原位雜交技術(shù)插入失活藍(lán)－白篩選第72頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）平板篩選

是指利用載體的遺傳性標(biāo)記直接篩選的方法。如，具有抗藥性標(biāo)記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培養(yǎng)平板上生長；未轉(zhuǎn)化的則不能生長。插入失活

當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。第73頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

抗生素平板篩選（插入失活）第74頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）藍(lán)-白篩選

它是一種利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑的篩選方法，篩選含有編碼β-半乳糖苷酶的基因。

載體：編碼β-半乳糖宿主：編碼β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列α-互補細(xì)菌表達(dá)：β-半乳糖苷酶活性蛋白↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成藍(lán)色菌落

當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能與宿主β-半乳糖苷酶的C端進(jìn)行α-互補→產(chǎn)生白色菌落。

（IPTG存在下）

第75頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

藍(lán)－白篩選示意圖第76頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月2.限制性內(nèi)切酶圖譜鑒第77頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月3.PCR篩選重組體

抽提少量重組DNA→PCR擴(kuò)增→電泳鑒定→序列分析。4.原位雜交技術(shù)第78頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月五、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控

基因工程的最終目的是通過載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

克隆基因表達(dá)有三個條件

⑴基因的編碼區(qū)不能被插入序列所中斷;

⑵基因轉(zhuǎn)錄要有啟動子，而啟動子必須能被宿主

細(xì)胞的RNA聚合酶有效地識別;

⑶mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外

源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解。第79頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用

一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)

1990年美國科學(xué)家首先啟動人類基因組計劃（HGP），計劃歷時15年，至2005年完成；

2001年2月12日由Since和Nature雜志同時向世界宣布，人類基因組3X109bp的最新圖譜，約含34萬個基因；整個人類基因組的全部核苷酸序列不久即將完成。但要揭示人類4萬個基因功能的任務(wù)將更為艱巨。第80頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

人類基因組圖譜的初步完成，不僅為全部基因的定位建立了一個開放框架，而且為分離、鑒定人類疾病相關(guān)基因提供了參照模板。如，已知人類遺傳性疾病約有3000種，推測可能是由于某些基因結(jié)構(gòu)異?；蚧蛭灰频韧蛔兯?。如果利用分子生物學(xué)技術(shù)，將患者疾病基因與正?；驁D譜作對照分析，必將有助于闡明遺傳病的分子機(jī)制，這對遺傳病的基因治療將起到不可估量的推動作用。第81頁，課件共91頁，創(chuàng)作于2023年2月

產(chǎn)品名稱治療功能與醫(yī)藥范圍

1.人胰島素