貝萊斯芽孢桿菌GDND-2-對煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響

/wswxtbcnJul.20,2023,50(7):2876?2Copyright?2023MicrobiologyChinaAllRightsReserved研究報告研究報告沈會芳，楊祁云，張景欣，蒲小明，孫大元，林壁潤*廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東廣州510640沈會芳沈會芳,楊祁云,張景欣,蒲小明,孫大元,林壁潤.貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響[J].微生物學通報,2023,50(7):2876-2891.SHENHuifang,YANGQiyun,ZHANGJingxin,PUXiaoming,SUNDayuan,LINBirun.EffectofBacillusvelenzensisGDND-2onthegrowthanddevelopmentofFusariumoxysporiumfromtobacco[J].MicrobiologyChina,2023,50(7):2876-2891.摘要：【背景】尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)引起的煙草根腐病在世界煙區(qū)普遍發(fā)生，嚴重影響煙草產(chǎn)量和質量，化學農(nóng)藥無法有效防治病害，利用生防菌防治該病成為研究熱點。【目的】明確貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelenzensis)GDND-2對尖孢鐮孢生長發(fā)育的抑制作用。【方法】制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基，涂在玻片上，接種尖孢鐮孢分生孢子，觀察濾液對尖孢鐮孢孢子萌發(fā)、菌絲生長、孢子形成和色素產(chǎn)生的影響，應用掃描和透射電鏡觀察菌體超微結構的變化?！窘Y果】貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液延遲孢子萌發(fā)2h以上造成芽管膨大畸形，促使菌絲提早分枝，抑制菌絲延伸，使菌絲產(chǎn)生畸形球狀結構，10%和20%發(fā)酵濾液對菌絲生長抑制率達53.41%和61.58%。濾液延遲病菌產(chǎn)孢，顯著抑制產(chǎn)孢量，影響孢子形態(tài)，刺激病菌產(chǎn)生色素。10%和20%發(fā)酵濾液延遲產(chǎn)孢20h和28h，對產(chǎn)孢量的抑制率為52.11%和78.85%，濾液促使病菌形成小型分生孢子。觀察尖孢鐮孢的超微結構，部分菌絲膨大、畸形，細胞壁變薄，細胞膜消失，細胞質滲出，胞內(nèi)呈空腔結構；部分菌絲嚴重皺縮、扭曲、變細，嚴重時出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象；部分菌絲細胞嚴重囊泡化，細胞器分布不均勻；部分細胞脂質體數(shù)量明顯增加?！窘Y論】貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液能抑制尖孢鐮孢的整個生產(chǎn)發(fā)育過程，包括孢子萌發(fā)、菌絲生長和孢子形成。關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌GDND-2；煙草鐮孢根腐病菌；生長發(fā)育；超微結構資助項目：廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊項目(2022KJ112)；廣東省煙草科技計劃(201908)ThisworkwassupportedbytheGuangdongModernAgriculturalIndustrialTechnologySystemInnovationTeamProject(2022KJ112)andtheGuangdongProvinceTobaccoScienceandTechnologyProject(201908).*Correspondingauthor.E-mail:linbr@126.comReceived:2022-07-12;Accepted:2023-01-17;Publishedonline:2023-03-22沈會芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響EffectofBacillusvelenzensisGDND-2onthegrowthanddevelopmentofFusariumoxysporiumfromtobacco*SHENHuifang,YANGQiyun,ZHANGJingxin,PUXiaoming,SUNDayuan,LINBirunInstituteofPlantProtection,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofNewTechniqueforPlantProtectioninGuangdongProvince,Guangzhou510640,Guangdong,ChinaAbstract:[Background]RootrotcausedbyFusariumoxysporumiscommonintobaccogrowingareasworldwide,severelythreateningthequalityandyieldoftobacco.Aschemicalpesticidesfailtoeffectivelycontrolthepathogen,biocontrolstrainshaveattractedtheinterestofscholars.[Objective]ToclarifytheinhibitoryeffectofBacillusvelenzensisGDND-2onthegrowthanddevelopmentofF.oxysporiumfromtobacco.[Methods]ThePDAcontaining10%and20%fermentationfiltrateofGDND-2wascoatedonglassslides,andthentheconidiaofF.oxysporumwereinoculated.Theeffectofthefermentationfiltrateonconidialgermination,hyphalgrowth,sporulation,andpigmentproductionofF.oxysporumwasinvestigated,andtheultrastructureofF.oxysporumhyphaewasobservedbyscanningandtransmissionelectronmicroscopy.[Results]AfterthetreatmentwithfermentationfiltrateofGDND-2,theconidialgerminationwasover2hlate.Thefermentationfiltrateresultedinthemalformationofgermtubesandearlybranchingofhyphae.Itinhibitedtheelongationofhyphaeandthustheyshowedmalformedsphericalstructure.Theinhibitionratesofhyphalgrowthby10%and20%fermentationfiltratewere53.41%and61.58%,separately.Thefermentationfiltratedelayedthesporulationofthepathogen,significantlyreducedthesporequantity,affectedtheconidialmorphology,andpromotedthepigmentproductionbythepathogen.Undertheactionof10%and20%fermentationfiltrate,thesporulationhappened20hand28hlate,respectively,andtheinhibitionratesofsporequantitywere52.11%and78.85%,separately.ThefermentationfiltratestimulatedF.oxysporumtoformmicroconidia.AsfortheultrastructureofF.oxysporium,somehyphaeswelledandmalformed,withthinnercellwall,disappearanceofcellmembrane,cytoplasmexudation,andintracellularcavitystructure.Somehyphaeshriveled,twistedandthinned,andperforatedinseverecases.Somehyphaecellswereseverelyvesiculatedandorganelledistributionwasuneven.Insomecells,thenumberofliposomesincreasedobviously.[Conclusion]ThefermentationfiltrateofB.velenzensisGDND-2inhibitedthegrowthanddevelopmentofF.oxysporum,includingconidialgermination,hyphalgrowth,andsporulation.Keywords:BacillusvelenzensisGDND-2;Fusariumoxysporum;growthanddevelopment;ultrastructure鐮孢(Fusarium)根腐病在世界煙區(qū)普遍發(fā)生，鐮孢既可單獨侵染，又可與黑脛病菌、青枯病菌、根結線蟲等混合侵染，造成煙葉大幅減產(chǎn)甚至絕收，成為嚴重危害煙草的根莖病害之一[1]。20世紀80?90年代，該病為美國康涅狄格和馬薩諸塞州闊葉雪茄煙上最具破壞性的病害，近20%煙田受到侵染[2]。此外，在希臘[3]、西班牙[4]、馬來西亞[5]等國也有發(fā)生。1998年，TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2878微生物學通報Micro桑維鈞等首次報道貴州省煙草鐮孢根腐病的危害[6]，此后該病在云南省[7]、福建省[8]、山東省[9]、湖北省[10]、安徽省[11]、河南省[12]等地均普遍發(fā)生。2013年河南平頂山煙區(qū)根腐病發(fā)病率在5%?10%，造成3000萬元的經(jīng)濟損失[13]。引起煙草根腐病的鐮孢種類較多，貴州省為尖孢鐮孢(Fusariumoxysporium)和茄病鐮孢(Fusariumsolani)[6]。湖北省、云南省經(jīng)鑒定是尖孢鐮孢[1,10]。福建省煙區(qū)為尖孢鐮孢、茄病鐮孢和半裸鐮孢(Fusariumsemitectum)，其中尖孢鐮孢致病性最強，是優(yōu)勢病原種群[8]。美國報道的病原主要是尖孢鐮孢，并在病害發(fā)生流行、抗病育種、病害防治等方面做了大量的工作[2]。此外，我國還報道有共享鐮孢(Fusariumcommune)[14]、木賊鐮孢(Fusariumequiseti)[15]和層出鐮孢(Fusariumproliferatum)[15]等侵染煙草。綜合多地對煙草根腐病的研究，尖孢鐮孢是引起根腐病的優(yōu)勢種群。煙草鐮孢根腐病防治方法有抗病品種、化學防治和生物菌劑等?？共∑贩N是最經(jīng)濟有效的防治措施，但不同產(chǎn)區(qū)致病鐮孢種類不同，同一煙草品種在不同種植區(qū)的抗性表現(xiàn)不同，難以向其他產(chǎn)區(qū)推廣應用，篩選適宜本地煙區(qū)的主栽抗性品種還任重道遠[16]。化學藥劑是控制該病的主要方法。精甲·噁霉靈在有效用量范圍內(nèi)防效為78.17%?82.94%[17]。62.5g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑在處理后46d相對防效達72.69%[18]。但因鐮孢根腐病為土傳病害，化學農(nóng)藥防治效果不理想，使生防菌的篩選成為研究熱點。對煙草鐮孢根腐病生防菌劑的研究相對較少，棘孢木霉(Trichodermaasperellum)Tr-0111對尖孢鐮孢的抑制率達93.13%，木霉發(fā)酵液使煙草種子萌發(fā)率提高5.34%，煙苗根長增長62.39%[19]。特基拉芽孢桿菌(Bacillusteqyilensis)KC121對煙草擬枝鐮孢(Fusariumsporotrichioodes)的抑制效果達82.66%，對腐皮鐮孢的抑菌率達76.9%，其發(fā)酵液對擬枝鐮孢和腐皮鐮孢的抑菌率分別為84.76%和60.85%[20]。陳長卿等應用4種芽孢桿菌類生物殺菌劑進行試驗，田間防效達42.97%?70.19%，且對煙草根、莖、葉均有不同程度的促進作用[17]。劉暢等將假單胞菌(Pseudomonassp.)與綠色木霉(Trichodermaharzianum)制成復合菌劑，均能降低煙田根莖病害發(fā)病率和病情指數(shù)，改善煙株農(nóng)藝性狀[21]。但在煙草鐮孢根腐病生防菌劑的研究方面存在以下問題：(1)為節(jié)省時間，研究者多將現(xiàn)有的生防菌劑引入進行防病試驗，防治效果不理想；(2)直接針對煙草鐮孢根腐病篩選的生防菌資源貯備較少，研究過程中，一旦生防菌性狀較差，難以繼續(xù)開展研究。然而美國有4株芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局(U.S.EnvironmentalProtectionAgency)商品化或有限商品化生產(chǎn)應用許可，分別是GB03、MBI600、QST713和Bacillusvar.amyloliquefaciensFZB24，其中，GB03、MBI600和FZB24都可用于防治尖孢鐮孢引起的枯萎或根腐病[22]。截至2022年6月，中國農(nóng)藥信息網(wǎng)尚無防治煙草鐮孢根腐病的生防藥劑登記。因此需要針對煙草鐮孢根腐病開展生防菌篩選，貯備菌種資源，并對生防菌防病機制進行深入研究。尖孢鐮孢為煙草根腐病的優(yōu)勢致病菌，貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelenzensis)GDND-2對煙草根腐病菌有明顯抑制作用。因為貝萊斯芽孢桿菌易于分離和培養(yǎng)，生長快，抗逆性強，代謝產(chǎn)物豐富，對人和動物安全無毒，具有豐富的次級代謝產(chǎn)物，所以它是理想的生防菌源，成為近年來的研究熱點[23]，研究論文、專利申請、產(chǎn)品開發(fā)等呈暴發(fā)式增長[24]。本文研究貝TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響萊斯芽孢桿菌GDND-2對尖孢鐮孢生長發(fā)育的影響，以期為揭示該生防菌株的防病機制提供依據(jù)。1.1.1菌株菌株GDND-2分離自廣東梅州五華煙草根圍土壤，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B.velenzensis)，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所。尖孢鐮孢(F.oxysporium)分離自廣東省韶關始興煙草根腐病株，經(jīng)致病性測定和病原菌鑒定為尖孢鐮孢，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所。1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和培養(yǎng)液(PDB)，青島海博生物技術有限公司，用于尖孢鐮孢的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基，用于生防菌的發(fā)酵；水瓊脂1.1.3主要試劑和儀器蛋白胨和酵母提取物，生工生物工程(上海)股份有限公司；生化培養(yǎng)箱和恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；熒光正置顯微鏡，蔡氏公司；掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡，日立公司。1.2菌株GDND-2發(fā)酵濾液的制備將100μLGDND-2菌液(108CFU/mL)接種于LB培養(yǎng)基中，于32℃、150r/min發(fā)酵培養(yǎng)36h后，15000r/min離心5min收集上清液，用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌，保留發(fā)酵濾液，?20℃保存?zhèn)溆谩?.3菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢生長發(fā)育的影響將GDND-2發(fā)酵濾液加入PDA(45℃)中，使濾液含量為10%和20%，吸取2mL涂在玻片上，凝固后滴50μL尖孢鐮孢孢子懸浮液(106個/mL)，涂抹均勻。以加等量LB培養(yǎng)基為每處理5片玻片，3次重復。每隔2h鏡檢孢子萌發(fā)、菌絲生長、孢子形成和色素產(chǎn)生情況。1.4菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢分生孢子萌發(fā)的影響制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的水瓊脂，吸取2mL涂在玻片上，凝尖孢鐮孢孢子懸浮液(106個/mL)，涂抹均勻。以重復。玻片放入培養(yǎng)皿，26℃黑暗保濕培養(yǎng)，培養(yǎng)8h，每個玻片隨機統(tǒng)計100個孢子萌發(fā)情況，計算萌發(fā)率。1.5菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌體生長量和孢子形成量的影響制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA(45℃)，倒入平皿，接入尖孢鐮孢菌餅(直徑6mm)，以加等量LB培養(yǎng)基為對照，每處理字交叉測量菌落直徑，計算各處理的菌絲生長速率及抑制率。菌絲生長速率=(處理菌落直徑–菌餅直徑)/培養(yǎng)菌絲生長抑制率(%)=(對照菌絲生長速率–處理菌絲生長速率)/(對照菌絲生長速率)×100。制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDB培養(yǎng)液，每瓶100mL，接入100μL尖孢鐮孢孢子懸浮液(106個/mL)，以加等量LB培養(yǎng)液為對照，每處理5瓶，3次重復，于26℃、150r/min培養(yǎng)4d，過濾保留菌體，無菌水沖洗3次，60℃烘干，稱重。菌體生長量=處理菌體干重/培養(yǎng)天數(shù)；菌體生長量抑制率(%)=(對照菌體生長量?處理菌體生長量)/對照菌體生長量×100。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2880微生物學通報Micro制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA(45℃)，倒入平皿，接入尖孢鐮孢菌餅(直徑6mm)，以加等量LB培養(yǎng)基為對照，每處理皿加10mL無菌水，刮掉孢子，鏡檢孢子量。產(chǎn)孢量抑制率(%)=(對照孢子量?處理孢子量)/(對照孢子量)×100。1.6菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌體外部形態(tài)的影響制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA平板，接入尖孢鐮孢菌餅，26℃黑暗培養(yǎng)4d，切取2mm×2mm菌塊，用2.5%戊二醛加多聚甲醛溶液在4℃冰箱固定3h，PBS沖洗樣品3次，依次30min。用1%鋨酸固定3h，PBS沖洗3次。依次30min用30%、50%、70%、90%、95%、100%、100%、100%酒精梯度脫水，每梯度處理20min。乙酸異戊酯置換20min。臨界點干燥，真空噴金。樣本置于掃描電鏡下觀察。1.7菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌體內(nèi)部形態(tài)的影響制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA平板，接入尖孢鐮孢菌餅，26℃黑暗培養(yǎng)4d，切取2mm×2mm菌塊，用2.5%戊二醛溶液在4℃冰箱固定3h，PBS沖洗樣品3次，每次30min。用1%鋨酸固定3h，PBS沖洗3次，100%、100%、100%酒精梯度脫水，每梯度處理20min。用環(huán)氧丙烷逐步置換，環(huán)氧丙烷與酒精比為1:3、2:2、3:1、100%、100%、100%，每梯度處理20min。用樹脂浸透后包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色。樣本置于透射電鏡下觀察。1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用DPS軟件處理數(shù)據(jù)，對試驗結果用鄧肯氏新復極差多重比較法(Duncan’smuitiplerangetest,DMRT)進行差異顯著性分析。2結果與分析2.1GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢分生孢子萌發(fā)和芽管形態(tài)的影響在水瓊脂培養(yǎng)基上，正常尖孢鐮孢孢子培養(yǎng)2?4h逐漸萌發(fā)，用10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液處理的孢子推遲至4?6h逐漸萌發(fā)。培養(yǎng)8h時，發(fā)酵濾液處理的孢子萌發(fā)率均在95%以上，與對照差異不顯著(表1)。因此在試驗濃度范圍內(nèi)，GDND-2發(fā)酵濾液對孢子萌發(fā)率影響不大。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4h，對照孢子萌發(fā)產(chǎn)生正常芽管(圖1A)。10%GDND-2發(fā)酵濾液處理的孢子也萌發(fā)產(chǎn)生芽管，但芽管出現(xiàn)明顯膨大現(xiàn)象，嚴重畸形(圖1B)；20%發(fā)酵濾液處理的孢子剛開始萌發(fā)，已可見芽管出現(xiàn)膨大現(xiàn)象(圖1C)。綜上可見，在試驗濃度范圍內(nèi)，GDND-2發(fā)酵濾液延遲孢子萌發(fā)，但對孢子萌發(fā)率影響不大，同時影響芽管的形態(tài)，造成芽管的膨大畸形。表1菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢分生孢子萌發(fā)的抑制作用Table1InhibitionoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onconidialgerminationofFusariumoxysporumfromtobaccoTreatmentConidialgerminationrate(%)Inhibitionrateofconidialgermination(%)10%fermentationfiltrate96.20±1.47a20%fermentationfiltrate95.00±1.41a2.46Control97.40±0.80a表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示5%水平上差異顯著.下同Dataaremean±SD,valuesinthesamecolumnfollowedbydifferentsmalllettersaresignificantlydifferentat0.05level.Thesamebelow.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響圖1菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢芽管形態(tài)的影響A：對照.B：10%發(fā)酵濾液處理.C：20%發(fā)酵濾液處理Figure1EffectsofthefermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2ongermtubemorphologyofFusariumoxysporumfromtobacco.A:Control.B:10%fermentationfiltratetreatment.C:20%fermentationfiltratetreatment.2.2菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌絲生長和形態(tài)的影響在PDA上培養(yǎng)8h，對照芽管已延長為細長的菌絲，菌絲直，粗細均勻，產(chǎn)生少量分枝(圖2A)，濾液處理的芽管也形成菌絲，但菌絲未有效延伸，產(chǎn)生較多分枝，大量菌絲膨大畸形(圖2B、2C)。培養(yǎng)16h，對照菌絲繼續(xù)生長延伸，并交織在一起，形成菌絲體(圖2D)，濾液處理的菌絲延長，在菌絲上形成大量畸形的球狀膨大，連成一串，呈捻珠狀，膨大處多中空，部分菌絲表現(xiàn)出粗細不均現(xiàn)象(圖2E、2F)；培養(yǎng)20h，對照菌絲正常生長，菌落更加濃密且有分生孢子梗產(chǎn)生(圖2G)，濾液處理的菌體交織成菌絲體，菌絲體內(nèi)可見大量球狀膨大發(fā)酵濾液可使尖孢鐮孢菌絲明顯畸形，抑制菌體正常發(fā)育。在含GDND-2發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基上，10%和20%發(fā)酵濾液顯著抑制尖孢鐮孢菌絲生長，對菌絲生長抑制率達53.41%和61.58%(圖3)。檢測各處理菌體生長量，10%和20%發(fā)酵濾液對菌體干重的抑制率僅為23.49%和30.46%(表2)。結果表明，發(fā)酵濾液對菌體生長量的抑制效果比對菌絲生長速率的抑制效果差。由圖3可見，GDND-2發(fā)酵濾液明顯抑制菌絲直徑，但與對照相比，濾液處理的菌落更致密、濃厚，因而菌體生長量下降較少。綜上，在試驗濃度范圍內(nèi)，GDND-2發(fā)酵濾液造成菌絲球狀膨大、嚴重畸形，無法正常延伸，對菌絲生長的抑制效果明顯，同時發(fā)酵濾液促使菌絲產(chǎn)生分枝，分枝短而多，表現(xiàn)為菌落致密而濃厚，菌體量即菌絲干重下降相對較少。2.3菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢分生孢子形成及孢子活力的影響正常尖孢鐮孢在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20h產(chǎn)生大量產(chǎn)孢梗并開始產(chǎn)孢，培養(yǎng)24h有大量孢子形成(圖4A)。10%GDND-2發(fā)酵濾液處理后，培養(yǎng)40h見菌絲體有少量孢子，培養(yǎng)44h孢子量明顯增加(圖4B)。20%發(fā)酵濾液處理后，在培養(yǎng)48h時才觀察到菌絲體產(chǎn)生極少量孢子，隨著培養(yǎng)時間延長，未見孢子量明顯增加(圖4C)。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2882微生物學通報MicroFigure2EffectsofthefermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onhyphalgrowthandmorphologyofFusariumoxysporumfromtobacco.A?C:Culturefor8h.D?F:Culturefor16h.G?I:Culturefor20h.A,D,G:Control.B,E,H:10%fermentationfiltratetreatment.C,F,I:20%fermentationfiltratetreatment.圖3菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌絲生長的抑制效果圖Figure3InhibitioneffectoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onhyphalgrowthofFusariumoxysporumfromtobacco.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響表2菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌體生長的抑制作用Table2InhibitionoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onhyphalgrowthofFusariumoxysporumfromtobaccoTreatmentHyphaldiameterHyphaldryweightGrowthspeed(mm/d)Inhibitionrate(%)Increasespeed(mg/d)Inhibitionrate(%)10%fermentationfiltrate53.41140.90±5.14b23.4920%fermentationfiltrate7.05±0.10c61.58128.05±5.91c30.46Control18.35±0.20a184.15±8.56a圖4菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢分生孢子形成的影響A：對照，培養(yǎng)24h.B：10%發(fā)酵濾Figure4EffectsoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onconidialformationofFusariumoxysporumfromtobacco.A:Control,culturefor24h.B:10%fermentationfiltratetreatment,culturefor44h.C:20%fermentationfiltratetreatment,culturefor48h.制備含GDND-2發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基，接種尖孢鐮孢，培養(yǎng)4d后檢測產(chǎn)孢量，結果見表3，GDND-2發(fā)酵濾液處理病菌可顯著降低產(chǎn)孢量，10%和20%發(fā)酵濾液處理后對產(chǎn)孢量的抑制率達52.11%和78.85%。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)酵濾液處理可影響尖孢鐮孢分生孢子的形態(tài)(圖5)。對照產(chǎn)生的孢子以1?4個隔膜的大型分生孢子為主，平均長度為30.03μm。10%和20%發(fā)酵濾液處理后，孢子多為0?1個隔膜的小型分生孢子，平均長度為12.85μm和12.45μm，與對照差異明顯(表3)。將處理后尖孢鐮孢所產(chǎn)生的孢子制成懸浮分生孢子萌發(fā)率均在95.80%以上，與對照差異不顯著。將懸浮液涂在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，孢子萌發(fā)后的芽管和菌絲形態(tài)均未出現(xiàn)膨大等畸形變異。綜上所述，GDND-2發(fā)酵濾液處理可延遲尖孢鐮孢產(chǎn)孢，顯著抑制產(chǎn)孢量，影響病菌所產(chǎn)生孢子形態(tài)，主要形成小型分生孢子，但小型分生孢子的萌發(fā)及生長發(fā)育無異常。2.4GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢產(chǎn)素的在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，對照尖孢鐮孢菌絲生長良好，白色，基物無色素；10%GDND-2發(fā)酵濾液處理后菌絲青灰色，基物無色素；20%發(fā)酵濾液處理后，部分菌絲灰色，基物內(nèi)出現(xiàn)磚紅色色素(圖6A)。培養(yǎng)48h，對照菌絲白色，基物無色素；發(fā)酵濾液處理的菌絲轉為白色，基物磚紅色(圖6B)。培養(yǎng)72h，發(fā)酵濾液處理TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2884微生物學通報Micro表3菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢分生孢子形成及孢子活力的抑制作用Table3InhibitionoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onconidialformationandactivityofFusariumoxysporumfromtobaccoofconidialInhibitionrateof20%fermentationfiltr圖5菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢分生孢子形態(tài)的影響A：對照.B：10%發(fā)酵濾液處理.C：20%發(fā)酵濾液處理Figure5EffectoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onconidialmorphologyofFusariumoxysporumfromtobacco.A:Control.B:10%fermen圖6菌株GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢產(chǎn)素的影響A：培養(yǎng)24h.B：培養(yǎng)48h.C：培養(yǎng)72hFigure6EffectoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onpigmentproductionofFusariumoxysporumfromtobacco.A:Culturefor24h.B:Culturefor48h.C:Culturefor72h.的菌落基物色素進一步加深，對照仍無色素產(chǎn)生(圖6C)。因此，GDND-2發(fā)酵濾液促進尖孢鐮孢色素的產(chǎn)生。2.5掃描電鏡觀察GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌體外部形態(tài)的影響正常尖孢鐮孢菌絲體圓潤、飽滿，粗細基本均勻(圖7A中a)，少量菌絲有輕微褶皺和溢縮(圖7A中b)。GDND-2發(fā)酵濾液處理后菌絲出現(xiàn)明顯縊縮現(xiàn)象(圖7B中c)，部分菌絲明顯膨大，如球狀(圖7C中d)，膨大后表現(xiàn)萎蔫、疲軟、皺TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響圖7菌株GDND-2對尖孢鐮孢菌體外部形態(tài)的影響A：對照.B?D：10%發(fā)酵濾液處理.E、F：20%發(fā)酵濾液處理Figure7EffectsofBacillusvelenzensisGDND-2onmycelialexternalmorphologyofFusafromtobacco.A:Control.B?D:10%fermentationfiltrat細胞也表現(xiàn)為皺縮、扭曲(圖7E中g)。20%發(fā)酵濾液處理后部分菌絲出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象(圖7F中h)。2.6透射電鏡觀察GDND-2發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌體內(nèi)部形態(tài)的影響正常尖孢鐮孢菌絲直徑在25μm左右，菌絲體細胞壁、細胞膜、線粒體、細胞質等超微結構清晰，分布均勻(圖8A)。菌株GDND-2發(fā)酵濾液處理后部分細胞膨大呈圓球狀，直徑達200μm以上，細胞壁變薄，細胞膜消失，細胞器分布于靠近細胞壁的邊緣部位，幾乎未見細TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2886微生物學通報Micro圖8菌株GDND-2對尖孢鐮孢菌體內(nèi)部形態(tài)的影響A：對照.B、C：10%發(fā)酵濾液處理.D：20%Figure8EffectsofBacillusvelenzensisGDND-2onmycelialinternalmorphologyofFusariumoxysporum.A:Control.B,C:10%fermentationfiltratetreatment.D:20%fermentationfiltratetreatment.cw:Cellwall;m:Mitochondria;v:Vesicle;l:Liposomes.胞質基質，菌絲內(nèi)呈空腔結構(圖8B)；部分細胞出現(xiàn)大面積囊泡，擠壓其他細胞器，使胞內(nèi)空腔部分明顯增加，細胞器分布不均勻(圖8C)；部分菌絲細胞內(nèi)形成大量脂質體，數(shù)量比正常菌絲明顯增加(圖8D)。3討論與結論生防菌常抑制尖孢鐮孢的孢子萌發(fā)、菌絲生長及對菌絲有致畸效果。芽孢桿菌(Bacillussp.)CYY-6和CYY-42發(fā)酵液可致尖孢鐮孢菌絲扭曲、斷裂、破碎[25]。貝萊斯芽孢桿菌3A3-15的次生代謝物致尖孢鐮孢菌絲扭曲、畸形，抑制孢子萌發(fā)作用較強，抑制率達93.2%[26]。短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)ZJY-1顯著抑制尖孢鐮孢孢子萌發(fā)和芽管伸長，使菌絲變得細弱、枯萎、褶皺[27]。貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液同樣可延遲尖孢鐮孢孢子萌發(fā)，造成芽管膨大畸形，可使菌絲產(chǎn)生畸形的球狀結構，促進菌絲產(chǎn)生分枝，抑制菌絲延伸。但GDND-2發(fā)酵濾液還可顯著抑制尖孢鐮孢產(chǎn)孢量，20%TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響發(fā)酵濾液抑制產(chǎn)孢量達78.85%，可大幅度降低病菌基數(shù)，同時改變病菌產(chǎn)生孢子的形態(tài)，刺激病菌產(chǎn)生色素，這在生防菌抑菌機理研究上很少報道。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)途徑主要控制細胞延伸，環(huán)腺苷酸單磷酸-蛋白激酶A(cyclicadenosinemonophosphate-proteinkinaseA,cAMP-PKA)途徑主要控制孢子形成，尖孢鐮孢的侵染性則由兩者雙重控制[28-29]。GDND-2促使尖孢鐮孢菌絲提早分枝，抑制菌絲延伸，顯著抑制產(chǎn)孢量，推斷GDND-2通過影響cAMP-PKA途徑和MAPK途徑降低尖孢鐮孢的侵染性。同時，GDND-2也影響病菌的孢子形態(tài)，處理后病菌由正常產(chǎn)生大型孢子為主變?yōu)楫a(chǎn)小型孢子為主?，F(xiàn)有報道基因folczf1[30]、folvam7[31]對尖孢鐮孢分生孢子的形態(tài)有調控作用，folstua[32]、foswi6[33]、folssol[34]、folprp4[35]調控其產(chǎn)孢量。foplc4對尖孢鐮孢的產(chǎn)孢類型和產(chǎn)孢量均有調控作用，對尖孢鐮孢黃瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)研究發(fā)現(xiàn)，基因野生型菌株只產(chǎn)生小型孢子，而foplc4菌株可產(chǎn)生兩種類型的分生孢子，floplc4菌株的產(chǎn)孢量較野生型降低82.2%[36]。GDND-2處理后極可能影響了相關基因的表達，從而改變產(chǎn)孢量和孢子的形態(tài)，這有待進一步研究。孔建等用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B-903處理后，尖孢鐮孢芽管頂端、菌絲末端及中央的多處細胞形成畸形的球狀結構，隨著處理時間的延長，球狀結構增加，連成一串，胞內(nèi)含物消失，變成空胞[37]。對比發(fā)現(xiàn)B-903和GDND-2對尖孢鐮孢的作用相似，推測GDND-2所產(chǎn)生的抑菌物質與B-903活性物質結構相似。B-903所產(chǎn)的殺菌活性物質為大分子多肽[38]，該物質對多種植物病原真菌具有強抑制活性[39]，可為GDND-2抑菌活性物質的研究提供參考。GDND-2發(fā)酵濾液可促使尖孢鐮孢產(chǎn)生磚紅色色素。鐮孢屬色素在功能上具有多樣性，部分色素具有抗菌、毒性功能、抗腫瘤活性等[40-41]。如禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)產(chǎn)生的色素具有抑菌功能，能夠抑制酵母生長[42]。輪狀鐮孢(Fusariumverticillioides)產(chǎn)生的色素與該菌的毒性有密切關系[43]。Medentsev等研究了多隔鐮孢(Fusariumdecemcellulare)、禾谷鐮孢和瓜類萎蔫鐮孢(Fusariumbulbigenum)產(chǎn)生萘醌類色素的條件，發(fā)現(xiàn)萘醌類色素具有抗菌活性，可對周圍競爭性菌類產(chǎn)生抑制和致毒作用，該色素合成是真菌抵御環(huán)境壓力的手段[40]。生防菌刺激尖孢鐮孢產(chǎn)生色素報道極少，GDND-2促使其產(chǎn)生的色素是否具有抗菌或毒性功能，無相關文獻可以參考，需要進一步研究。劉群等報道鏈霉菌(Streptomycessp.)N2所產(chǎn)農(nóng)抗N2使橘青霉(Penicilliumcitrinum)細胞內(nèi)物質密度降低，細胞內(nèi)嚴重囊泡化，細胞質出現(xiàn)無序排列，降低病菌細胞的活力[44]，同樣地，GDND-2發(fā)酵濾液也使尖孢鐮孢部分細胞囊泡化嚴重，內(nèi)部空腔面積增加，細胞器分布不均，但本研究還觀察到尖孢鐮孢部分細胞內(nèi)形成大量脂質體。脂質體主要功能是為菌體提供碳源和能量，李璇等報道37℃和40℃的高溫條件下，黃曲霉脂質體數(shù)量的急劇增加可為高溫脅迫下的黃曲霉細胞提供更多的能量和儲能物質，減輕高溫對黃曲霉生長帶來的傷害[45]。因此，推斷生防菌GDND-2發(fā)酵濾液處理后部分細胞脂質體數(shù)量明顯增加，是病菌為抵御生防菌保護自身的一種方式。綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液造成尖孢鐮孢芽管膨大畸形，促使菌絲提TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2888微生物學通報Micro早產(chǎn)生分枝，抑制菌絲延伸，引起菌絲扭曲、球狀膨大、畸形，顯著抑制菌絲生長，延遲病菌產(chǎn)生孢子，嚴重抑制產(chǎn)孢量，造成菌絲內(nèi)部空腔化、囊泡化，病菌形態(tài)的改變可能會影響病菌對寄主的侵染能力，降低病菌致病性。研究表明貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液能抑制尖孢鐮孢的整個生產(chǎn)發(fā)育過程，包括孢子萌發(fā)、菌絲生長、孢子形成并促使病菌產(chǎn)生色素。REFERENCES[1]蓋曉彤,代快,戶艷霞,王繼明,姜寧,盧燦華,夏振遠.云南省煙草鐮刀菌根腐病菌遺傳多樣性分析[J].中國煙草學報,2022,28(5):113-120.GAIXT,DAIK,HUYX,WANGJM,JIANGN,LUCH,XIAZY.GeneticdiversityofFusariumoxysporumisolatescausingtobaccorootrotinYunnan[J].ActaTabacariaSinica,2022,28(5):113-120(inChinese).[2]LAMONDIAJA.Fusariumwiltoftobacco[J].CropProtection,2015,73:73-77.[3]TJAMOSSE,MARKAKISEA,ANTONIOUP,PAPLOMATASEJ.FirstrecordofFusariumwiltoftobaccoinGreeceimportedasseedborneinoculum[J].JournalofPhytopathology,2006,154(4):193-196.[4]ALVES-SANTOSFM,MARTíNEZ-BERMEJOD,RODRíGUEZ-MOLINAMC,DIEZJJ.Culturalcharacteristics,pathogenicityandgeneticdiversityofFusariumoxysporumisolatesfromtobaccofieldsinSpain[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2007,71(1/2/3):26-32.[5]BINJUSOHMN,ZINNBM,NAGAOH.VegetativecompatibilitygroupofFusariumsolanipathogenictotobaccoplantinpeninsularMalaysia[J].SongklanakarinJournalofScienceandTechnology(SJST),2013,35(6):615-621.[6]桑維鈞,祝明亮,吳興祿,鐘黔英,李永順.煙草鐮刀菌根腐病研究初報[J].山地農(nóng)業(yè)生物學報,1998,17(3):140-141,145.SANGWJ,ZHUML,WUXL,ZHONGQY,LIYS.ApreliminaryreportoftobaccorootrotcausedbyFusariumsp.[J].JournalofMountainAgricultureandBiology,1998,17(3):140-141,145(inChinese).[7]陳瑞泰,朱賢朝,王智發(fā),郭振業(yè),董漢松,王蘭珍,劉延榮,石金開.全國16個主產(chǎn)煙省(區(qū))煙草侵染性病害調研報告[J].中國煙草科學,1997,18(4):1-7.CHENRT,ZHUXC,WANGZF,GUOZY,DONGHS,WANGLZ,LIUYR,SHIJK.Areportofinvestigatingandstudyingtobaccoinfectiousdiseasesof16maintobaccoproducingprovinces(regions)inChina[J].ChineseTobaccoScience,1997,18(4):1-7(inChinese).[8]陳志敏.福建省煙草根莖病害診斷及防治藥劑篩選[D].福州:福建農(nóng)林大學碩士學位論文,2009.CHENZM.DiagnosisandscreeningchemicalstocontroloftobaccorootandstemdiseasesinFujianProvince[D].Fuzhou:Master’sThesisofFujianAgricultureandForestryUniversity,2009(inChinese).[9]趙杰.山東省煙草鐮刀菌根腐病病原及生物學特性的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文,2013.ZHAOJ.IdentificationandstudyonbiologicalcharacteristicsofthepathogenofFusariumcausingtobaccoroot-rotinShandongProvince[D].Beijing:Master’sThesisofChineseAcademyofAgriculturalSciences,2013(inChinese).[10]陳高航.煙草根腐病病原鑒定及其生物學特性觀察[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文,2013.CHENGH.Theidentificationoftobaccorootrotpathogenanditsbiologicalcharacteristics[D].Wuhan:Master’sThesisofHuazhongAgriculturalUniversity,2013(inChinese).[11]李冰.煙草新病害:莖黑腐病及安徽省煙田土壤幾種病原物的分子檢測研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文,2013.LIB.Newdiseaseoftobacco:stemsblackrotandmoleculardetectionoftobaccofieldpathogensinAnhuiProvince[D].Hefei:Master’sThesisofAnhuiAgriculturalUniversity,2013(inChinese).[12]田艷艷,王偉杰,苗圃,李淑君,康業(yè)斌.河南煙草鐮刀菌的初步分子鑒定[J].煙草科技,2014,47(11):89-92.TIANYY,WANGWJ,MIAOP,LISJ,KANGYB.PreliminarymolecularidentificationofFusariuminfectingtobaccoinHenan[J].TobaccoScience&Technology,2014,47(11):89-92(inChinese).[13]李海江,王正平,宋學立,林娟,劉迎昌,趙鳳霞.河南省平頂山煙區(qū)煙草根腐病發(fā)病情況調查及EM菌劑防治效果研究[J].農(nóng)學學報,2017,7(2):25-30.LIHJ,WANGZP,SONGXL,LIN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