SN-T 4656.9-2023 進(jìn)出口紡織品生物安全檢驗(yàn)方法 第9部分：腸出血性大腸桿菌O157：H7

9SN/T4656.—20239進(jìn)出口紡織品生物安全檢驗(yàn)方法H第9部分:腸出血性大腸桿菌O157:7H1

范圍本文件規(guī)定了進(jìn)出口紡織品中腸出血性大腸桿菌

O157:H7的檢驗(yàn)方法。本文件適用于進(jìn)出口紡織品腸出血性大腸桿菌

O157:H7的檢驗(yàn)。2

規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法28SN/T1538. 培養(yǎng)基制備指南 第1部分:實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則28SN/T1538. 培養(yǎng)基制備指南 第2部分:培養(yǎng)基性能測(cè)試實(shí)用指南SN/T4656. 進(jìn)出口紡織品生物安全檢驗(yàn)方法 第8部分:通則13

術(shù)語、定義和縮略語13. 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。113..11ie紡織品生物安全

biosafetyoftextlie一般是指紡織品中攜帶的有害生物本身或其代謝產(chǎn)物對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生的潛在威脅,及對(duì)其所采取的一系列有效預(yù)防和控制措施。123..12H c Hi i腸出血性大腸桿菌O157:7

Enterohemorrhagi

EscherH c Hi i腸出血性大腸桿菌

O157:H7是腸出血性大腸桿菌的主要致病菌株,是與公共衛(wèi)生有關(guān)的最重要的出血性大腸桿菌的血清類型,是一種可引起人或牲畜腸出血性腹瀉等疾病的細(xì)菌性病原體。此病原細(xì)菌為革蘭氏染色陰性、兩端鈍圓的短桿菌,最適生長溫度為37℃,不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇,不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)產(chǎn)生熒光。133..13i實(shí)時(shí)熒光 PCRrealtmePCRi在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光化學(xué)物質(zhì)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物總量的方法。143..14lCt值 Cycethresholdl每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。14. 無菌規(guī)格板:0cm

。94. 無菌規(guī)格板:0cm

。923. 縮略語2下列縮略語適用于本文件。4 f 4MUG(-Methylumbeliery-βD-Glucuronide):-4 f 4p i id i li ip i id i li iiDNA

(eoxyrbonucecacd):脫氧核糖核酸。Taq(Thermusaquatcus):水生棲熱菌。i l

i idNTP(eoxyrbonuci l

i i4

材料和設(shè)備14. 無菌剪刀、鑷子。1234. 電子天平:感量0.1g。234. 無菌均質(zhì)袋。4 44. 拍擊式均質(zhì)器:004 4264. 無菌干燥棉拭子。67 58 394. 微量移液器:量程0.

μL~20μL,量程100μL~1000μL,量程17 58 394.

恒溫培養(yǎng)箱:6℃±1℃。4. 接種環(huán)。 31114.0

長波紫外光燈:65nm,功率≤6 31114.1

全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。4.2

載玻片。 :

5114.3

滅菌離心管

:

5114.4

PCR反應(yīng)管。 2114.5

高速冷凍離心機(jī):000r/min~13000 2114.6

熒光PCR儀。5

培養(yǎng)基和試劑除有特殊說明,所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純;分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用水符合

GB/T6682中一級(jí)水的要求。1 22 C 33 44 55 66 771 22 C 33 44 55 66 77 88 95.

改良山梨醇麥康凱(T-SMAC)瓊脂:符合附錄

A中

A.。5.營養(yǎng)瓊脂:符合附錄

A中

A.。5.

吲哚培養(yǎng)基:符合附錄

A中

A.。5. 柯凡克試劑:符合附錄

A中

A.。5. MR-VP培養(yǎng)基:符合附錄

A中

A.。5. 甲基紅試劑:符合附錄

A中

A.。5. V-P甲、乙液:符合附錄

A中

A.。9 15. 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基:符合附錄

A中

9 1 L 11 1115.0

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨-MUG(ST-MUG):符合附錄

A L 11 1115.1

山梨醇發(fā)酵管:符合附錄

A中

A.2。5.2

生化鑒定試劑盒。25個(gè)采樣點(diǎn),用無菌規(guī)格板

4.5)比照按每個(gè)采樣點(diǎn)20cm5個(gè)采樣點(diǎn),用無菌規(guī)格板

4.5)比照按每個(gè)采樣點(diǎn)20cm

面積范圍均勻涂抹,每個(gè)采樣點(diǎn)用1個(gè)無菌9115.3

腸出血性大腸桿菌

O157和

H7診斷血清。115.4

滅菌雙蒸水。 / /2 i- i 0p15.5

DNA提取液:0mmol

LTrsHCl,2mmol / /2 i- i 0p1用商業(yè)化的DNA提取試劑盒。 / //2 i- 4

2 1p1 / /111 515.6

10×PCR緩沖液:00 / //2 i- 4

2 1p1 / /111 515.7

dNTP混合液(0mmol

L):每種核苷酸濃度10mmolL。5.8

引物和探針:引物和探針序列符合附錄B。5.9

TaqDNA聚合酶(U/μL)。 C25.0

標(biāo)準(zhǔn)菌株:大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ICC10389或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株),腸出血性大腸桿菌

O157:H7 C2C菌株(ICC21530或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)。C6

樣品制備1116. 樣品制備方法1116.. 稱量法( (( (12無菌方法打開送檢樣品,用無菌剪刀

4.1)均勻剪樣,在電子天平

4.2)上準(zhǔn)確稱取剪下的( (( (1225g,剪碎后加入到盛有225mL

mTSB(5.1)的無菌均質(zhì)袋

4.3)中,用拍擊式均質(zhì)器

4.4)拍打1min~2min,充分混勻。6.. 多點(diǎn)采樣洗脫法(2((無菌方法打開送檢樣品,在樣品四周和中間均勻布控5個(gè)采樣點(diǎn),用無菌規(guī)格板

4.5)比照每個(gè)采(2((樣點(diǎn)按4cm×5cm(0cm2)面積范圍剪裁,每20cm2

采樣面積為1份檢樣,每件樣品共采集5份檢樣,采樣面積為100cm2。將上述采集好的5份檢樣放入盛有200mLmTSB(5.1)的無菌均質(zhì)袋

4.3)中,用拍擊式均質(zhì)器

4.4)拍打1min~2min,充分混勻,得到一個(gè)樣品洗脫液。136.. 棉拭子涂抹法13(無菌方法打開送檢樣品,用

mTSB(5.1)濕潤無菌干燥棉拭子

4.6),在樣品四周和中間均勻布控(2(2 ((干燥棉拭子

4.6),在4cm×5cm(0cm2)面積范圍均勻涂抹,立即用無菌剪刀

4.1)剪去棉拭子(2 ((觸部分,將涂抹部分一起放入盛有50mLmTSB(5.1)的無菌均質(zhì)袋

4.3)中混勻。26.樣品制備方法選擇原則2216.. 樣品制備一般依6.1.

方法為基準(zhǔn)方法;2122 2 26.. 當(dāng)樣品為面積較大或較厚實(shí)或多孔時(shí),樣品制備應(yīng)采用6.1.

方法。22 2 2檢樣品面積過大或過小,采樣點(diǎn)可按比例增加或減少。23 36.. 當(dāng)樣品質(zhì)地致密不容易剪碎制備;或樣品較貴重,客戶要求無損檢測(cè)的,23 3方法。24 26.. 采用6.1.1、6.1.

方法時(shí)如果被檢樣品大量吸水而導(dǎo)致不能吸出足夠樣品勻液轉(zhuǎn)種時(shí)24 2可適當(dāng)增加直至足夠吸出轉(zhuǎn)種。39SN/T4656.—20239H17

方法一 腸出血性大腸桿菌O157:7傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法H17. 原理利用腸出血性大腸桿菌

O157:H7不能發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇的特性,接種含山梨醇的CT-SMAC瓊脂平板進(jìn)行初篩分離;利用腸出血性大腸桿菌

O157:H7不能分解4-甲基傘形酮-βD-葡萄糖醛酸苷(MUG)產(chǎn)生熒光(MUG試驗(yàn)陰性)的特性,結(jié)合血清學(xué)實(shí)驗(yàn),準(zhǔn)確判定腸出血性大腸桿菌

O157:H7。27. 檢驗(yàn)程序2檢驗(yàn)程序見圖1。H圖1

腸出血性大腸桿菌O157:7傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法程序H3317. 操作步驟3317.. 增菌1 (將按6.

制備好的樣品勻液放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱

4.8)中,增菌培養(yǎng)241 (327.. 分離32( 1 ((用無菌接種環(huán)

4.9)挑取7.3.

增菌液接種于兩個(gè)CT-SMAC

5.2)平板。放置36℃±1℃( 1 ((培養(yǎng)箱

4.8)培養(yǎng)24h±2h。培養(yǎng)結(jié)束后觀察各個(gè)平板上菌落生長情況,如無可疑或典型菌落生長,可直接報(bào)告樣品中腸出血性大腸桿菌

O157:H7未檢出;如有可疑或典型菌落長出,則挑取可疑或典型菌落純化后進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)確認(rèn)。CT-SMAC平板上腸出血性大腸桿菌

O157:H7典型菌落特征淡褐色中心、扁平透明、邊緣光滑。337.. 純化菌落33(分別挑取CT-SMAC選擇性平板上5個(gè)以上可疑或典型菌落,接種營養(yǎng)瓊脂

5.3)平板,于36℃±(1℃培養(yǎng)24h±2h純化,挑取純化后的菌落同時(shí)做如下確證實(shí)驗(yàn)。49SN/T4656.—20239347.. 生化試驗(yàn)343417... 吲哚試驗(yàn)341(( 1342挑取7.3.

純化后的單個(gè)菌落接種吲哚培養(yǎng)基

5.4),置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2(( 1342試劑

5.5)0.

mL,陽性反應(yīng)出現(xiàn)紅色環(huán),陰性為黃棕色環(huán)。腸出血性大腸桿菌

O157:H7能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚,試驗(yàn)陽性。7... MR-VP試驗(yàn)( 3( 2 (挑取7.3.

純化后的菌落分別接種兩管

MR-VP培養(yǎng)基

5.6),6℃±1℃培養(yǎng)( 3( 2 (滴加甲基紅試劑

5.7)

滴~3滴,立即觀察結(jié)果;一管按6∶2的比例依次滴加

V-P甲、乙液

5.8)后30min內(nèi)觀察結(jié)果。變紅色為陽性,不變色為陰性。腸出血性大腸桿菌

O157:H7能分解葡萄糖,加入甲基紅指示劑立即顯紅色,即

MR試驗(yàn)陽性,滴加

V-P甲、乙液后顏色不變,即

VP試驗(yàn)陰性。3437... 檸檬酸鹽試驗(yàn)343(挑取7.3.

純化后的單個(gè)菌落接種西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基

5.9)后36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h,觀(察其顏色變化情況。腸出血性大腸桿菌

O157:H7不能利用檸檬酸鹽為碳源,檸檬酸鹽試驗(yàn)陰性。培養(yǎng)基顏色不變。3447... MUG試驗(yàn)344(CC ((挑取7.3.3

純化后的單個(gè)菌落接種

LST-MUG

肉湯管

5.9),同時(shí)取大腸埃希氏標(biāo)準(zhǔn)菌(CC (((ICC10389或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)(5.20)菌液接種

LST-MUG

肉湯管做陽性對(duì)照,取腸出血性大腸桿菌O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株(ICC21530或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)(5.20)菌液接種

LST-MUG

肉湯管

5.9)做陰性對(duì)照。于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。培養(yǎng)結(jié)束后將LST-MUG肉湯管置長波紫外燈

4.10)下觀察,大腸埃希氏菌株

MUG陽性,有熒光產(chǎn)生;腸出血性大腸桿菌

O157:H7MUG陰性,無熒光產(chǎn)生。3457... 山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)345(挑取7.3.

純化后的單個(gè)菌落接種山梨醇發(fā)酵管

5.11),置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h后觀察是(否發(fā)酵。腸出血性大腸桿菌

O157:H7不能發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇,發(fā)酵管藍(lán)綠色或不變色。( (注:如選擇商品化生化鑒定試劑盒

5.12)或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)

4.11),可選擇7.3.

純化后的菌落( (對(duì)應(yīng)操作說明書進(jìn)行試驗(yàn)。357.. 血清學(xué)試驗(yàn)353517... 腸出血性大腸桿菌O抗原鑒定351( (( ((1取出腸出血性大腸桿菌

O157診斷血清

5.13),恢復(fù)室溫;取出干凈載玻片( (( ((1量移液器

4.7)吸取20μL腸出血性大腸桿菌

O157診斷血清

5.18)滴加于載玻片中央;用接種環(huán)4.9)挑取營養(yǎng)瓊脂平板上分純單個(gè)菌落于血清中,慢慢磨開使其混勻成乳狀液,靜置,min后觀察凝集情況。將載玻片傾斜搖動(dòng)混合1min,并對(duì)著黑暗背景進(jìn)行觀察,任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。3527... 腸出血性大腸桿菌

H抗原鑒定352( (用腸出血性大腸桿菌

H7診斷血清

5.13)代替腸出血性大腸桿菌

O157診斷血清

5.13),方法( (17.3.5.。159SN/T4656.—2023947. 結(jié)果報(bào)告4綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果,報(bào)告樣品中檢出或未檢出腸出血性大腸桿菌

O157:H7。H18

方法二 腸出血性大腸桿菌O157:7實(shí)時(shí)熒光PCR法H18. 原理f4根據(jù)腸出血性大腸桿菌

O157:H7特有的rbE保守序列,設(shè)計(jì)一組PCR特異性引物和熒光雙標(biāo)記f4探針(兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán))。PCR擴(kuò)增時(shí),反應(yīng)體系中加入

DNA

模板、引物、探針、

種脫氧核苷酸酶。目標(biāo)菌不存在時(shí),探針完整,報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,沒有熒光信號(hào)產(chǎn)生;目標(biāo)菌存在時(shí),探針被

Taq酶酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條

DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,達(dá)到熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步,從而準(zhǔn)確判定目標(biāo)菌存在與否。28. 檢測(cè)程序2檢測(cè)程序見圖2。H圖2

腸出血性大腸桿菌O157:7實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)程序H38. 操作步驟3318.. 樣品

DNA

模板的提取315 (( (( ((樣品增菌參照7.3.1,取1mL增菌液,放入1.

mL滅菌離心管

4.13)內(nèi),置高速冷凍5 (( (( ((4.15)內(nèi)10000r/min離心5min,吸棄上清;加入1mL滅菌雙蒸水

5.14)混勻,高速冷凍離心機(jī)4.15)內(nèi)10000r/min離心5min,吸棄上清;然后加滅菌雙蒸水

5.14)00μL混勻,置100

℃煮沸5min,高速冷凍離心機(jī)

4.15)內(nèi)10000r/min離心2min,取上清作為

DNA

模板,可-20℃存放備(用。也可使用等效的商品化DNA提取試劑盒

5.15)并按其說明操作。(6組分1管試驗(yàn)用量n

管試驗(yàn)用量10×PCR緩沖液(5.16)2.5μLn×2.5μLdNTP混合液(10mmol/L)(5.17)1.0μLn×1.0μL上游引物(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μL下游引物(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μL探針(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)(5.19)0.5μLn×0.5μL滅菌雙蒸水(5.14)16.0μLn×16.0μL總體積23.0μLn×23.0μL注:上、下游引物終濃度為0.4μmol/L,探針終濃度0.4μmol/L。9SN/T4656.—20239323218.. DNA

擴(kuò)增反應(yīng)323218... 擴(kuò)增準(zhǔn)備(n根據(jù)樣本數(shù)量設(shè)定所需要的PCR反應(yīng)管

4.14)數(shù)n(=1管空白對(duì)照+1管陰性對(duì)照+1(n對(duì)照+樣本數(shù))。擴(kuò)增反應(yīng)體系見表1,按表1計(jì)算各試劑的使用量,按順序加入滅菌

PCR

反應(yīng)管(24.14)內(nèi),顛倒混勻,000r/min離心10s,分裝至n

個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi),每管(2表1

反應(yīng)體系 對(duì)照、表1

反應(yīng)體系 對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照3228... 空白

空白對(duì)照:以水代替DNA模板。1陰性對(duì)照:以水代替樣品按8.3.

提取模板DNA作為PCR反應(yīng)的模板。1( 1陽性對(duì)照:腸出血性大腸桿菌

O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株

5.20)增菌后按8.3.

提取模板

DNA( 1段的陽性克隆分子DNA。3238... 加樣32310 1將8.3.

制備好的DNA模板、空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各取2.

μL10 12的反應(yīng)管中,使反應(yīng)體系達(dá)到25μL。蓋緊管蓋,混勻,000r/min離心10s。23248... 擴(kuò)增3243 ( 3 9 9將8.3.2.

反應(yīng)管置實(shí)時(shí)熒光PCR儀

4.16)中。反應(yīng)參數(shù):7℃5min,53 ( 3 9 96 4變性5s,0℃退火延伸40s,同時(shí)收集熒光,06 448. 結(jié)果分析4418.. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)41C陰性對(duì)照:無擴(kuò)增曲線,t≥40.;CC陽性對(duì)照:出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,t<30.;否則,實(shí)驗(yàn)視為無效。C79SN/T4656.—20239428.. 結(jié)果判定420a)

Ct≥40.,可判定樣品結(jié)果為陰性,可直接報(bào)告樣品未檢出腸出血性大腸桿菌

O157:H7。0b)

Ct≤35.,可判定該樣品結(jié)果為陽性;c)

35.0<Ct<40,建議樣本重做,重做結(jié)果如Ct≥40為陰性,否則為陽性。對(duì)于陽性結(jié)果,參見方法一進(jìn)行確認(rèn)。58. 結(jié)果報(bào)告5根據(jù)確認(rèn)結(jié)果報(bào)告樣品中檢出或未檢出腸出血性大腸桿菌

O157:H7。9

防止污染和廢棄物處理的措施應(yīng)符合SN/T4656.8的規(guī)定。89SN/T4656.—20239附 錄

A(規(guī)范性)培養(yǎng)基和試劑1A. 培養(yǎng)基制備及質(zhì)量保證12按SN/T1538.

和SN/T1538.

制備培養(yǎng)基并進(jìn)行性能測(cè)試,如使用等效商品化脫水合成培養(yǎng)2基,使用前對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)收并按其說明書使用。2 (21A. 改良胰蛋白胨大豆肉湯

2 (21A.. 成分0055000胰酪蛋白胨 17.g0055000大豆蛋白胨 3.gD-葡萄糖 2.g3號(hào)膽鹽 1.氯化鈉 5.g磷酸氫二鉀 4.g新生霉素鈉鹽溶液 1.

mL蒸餾水 1000mL22A.. 制法2221除新生霉素鈉鹽溶液外,準(zhǔn)確稱取其余成分混合加入1000mL蒸餾水中,加熱溶解,室溫調(diào)節(jié)21至7.0±0.,21℃高壓滅菌15min。取出冷卻至50℃以下時(shí),加入1mL新生霉素鈉鹽溶液,混勻備用。3 C31 S311A. 改良山梨醇麥康凱3 C31 S311A..山梨醇麥康凱(MAC)瓊脂A... 成分050蛋白胨 20.g050氯化鈉 5.g山梨醇 10.g3號(hào)膽鹽 1.g瓊脂 15.g中性紅0.3g結(jié)晶紫 0.01g蒸餾水 1000mL312A... 制法312除瓊脂、中性紅、結(jié)晶紫外,準(zhǔn)確稱取其余成分混合加入1000mL蒸餾水中,加熱溶解,室溫調(diào)節(jié)1pH

至7.2±0.,加入瓊脂、中性紅、結(jié)晶紫,煮沸溶解,21℃高壓滅菌15min。199SN/T4656.—2023932321A..亞碲酸鉀溶液32321A... 成分5亞碲酸鉀 0.g5蒸餾水 200mL322A... 制法322準(zhǔn)確稱取亞碲酸鉀溶于蒸餾水中,過濾除菌備用。33331A.. 頭孢克肟溶液33331A... 成分0頭孢克肟 1.

mg095%乙醇 200mL332A... 制法332將頭孢克肟溶解于95%乙醇中,靜置1h待其充分溶解后過濾除菌。分裝試管,儲(chǔ)存于-20℃,有效期1年。解凍后的頭孢克肟溶液不易在凍存,且在0℃~4℃下存放有效期2周。34A.. CT-SMAC平板制備34取1000mL滅菌融化并冷卻至46℃的SMAC瓊脂,加入1mL亞碲酸鉀溶液和10mL頭孢克肟溶液,混勻后傾注平板。441A. 營養(yǎng)瓊脂441A.. 成分000蛋白陳 10.g000牛肉膏 3.g氯化鈉 5.g瓊脂 15.g蒸餾水 1000mL42A.. 制法421 1將上述成分混合后,加熱溶解,室溫調(diào)pH7.4±0.,分裝到玻璃容器內(nèi),21℃高壓滅菌201 1平板傾注15mL~20mL瓊脂,備用。551A. 吲哚培養(yǎng)基551A.. 成分00蛋白胨 10.g00氯化鈉 5.gDL-色氨酸 1.g蒸餾水 1000mL109SN/T4656.—2023952A.. 制法52521 /522A... 準(zhǔn)確稱取除DL-色氨酸外其他成分加入1000mL蒸餾水中,攪拌均勻,靜置約10521 /522A...準(zhǔn)確稱取DL-色氨酸加入約4mL1molL氫氧化鈉溶液中,完全溶解。523 4 1 1A...將兩液進(jìn)行混合,加熱煮沸至完全溶解,調(diào)pH7.

±0.,分裝試管(523 4 1 15 1管1.

mL,21℃高壓滅菌15min,5 1661A. 柯凡克試劑661A.. 成分對(duì)二甲氨基苯甲醛 10.g戊醇 150mL濃鹽酸 50mL62A.. 制法62準(zhǔn)確稱取對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,緩慢攪拌加入鹽酸,加熱至60℃,呈深黃色,靜置6h~7h,變成黃色即可使用。771A.MR-VP培養(yǎng)基771A.. 成分000胨 7.g000葡萄糖 5.g磷酸氫二鉀 5.g蒸餾水 1000mL72A.. 制法722 1稱取各成分溶于水中,加熱溶解,調(diào)pH6.9±0.,分裝試管,21℃高壓滅菌152 1881A. 甲基紅試劑881A.. 成分1甲基紅 0.g195%乙醇 300mL82A..