HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)課件

HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)窗口期的意義窗口期：廣義的講，從病原體侵入機(jī)體到用現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)室手段可以證明受到感染的期限稱(chēng)為窗口期。狹義的講，HIV感染后至抗體檢出前的一段時(shí)間稱(chēng)為窗口期。檢測(cè)HIV感染的實(shí)用方法是檢測(cè)抗-HIV，在免疫功能正常人群，其窗口期為2-12周。正確選擇檢測(cè)時(shí)機(jī)—通常在危險(xiǎn)暴露后3個(gè)月檢測(cè)，把握度在95%以上正確解釋檢測(cè)結(jié)果---陰性只能說(shuō)明3個(gè)月以前沒(méi)遭受感染，不可以說(shuō)“檢測(cè)沒(méi)事兒”“安全用血”—只是相對(duì)做到安全，因處于窗口期的供血，檢測(cè)不到抗-HIV。2HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV感染急性期（早期）：癥狀出現(xiàn)在感染后6周以?xún)?nèi)，類(lèi)似感冒，出現(xiàn)異常淋巴細(xì)胞升高潛伏期：感染到AIDS發(fā)病前，數(shù)月-10年以上?？?HIV陽(yáng)性、P24抗原或病毒分離在早期陽(yáng)性，以后不定或陰性，核酸檢測(cè)由陽(yáng)性到不確定到陽(yáng)性艾滋病早期：持續(xù)發(fā)熱、持續(xù)淋巴結(jié)腫大、可以有持續(xù)性腹瀉；體重減輕，可以發(fā)生機(jī)會(huì)性感染艾滋病期：保持和發(fā)展AIDS早期癥狀，出現(xiàn)多種機(jī)會(huì)性感染，神經(jīng)細(xì)胞和功能損傷的表現(xiàn)，易發(fā)生多種腫瘤*AIDS的病程通常2年

3HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)關(guān)于檢測(cè)抗-HIV的殘余危險(xiǎn)度含義：在目前條件下，篩查后仍具感染性的機(jī)率稱(chēng)為殘余危險(xiǎn)度。影響因素：*窗口期和檢測(cè)時(shí)機(jī)的選擇問(wèn)題

*實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控*個(gè)別人免疫功能低下，對(duì)HIV無(wú)反應(yīng)*試劑質(zhì)量和保存問(wèn)題*是否在有效期內(nèi)使用*試驗(yàn)操作錯(cuò)誤：標(biāo)本或結(jié)果登記的差錯(cuò)、儀器校準(zhǔn)否、錯(cuò)誤的操作

4HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)前病毒

HIV進(jìn)入宿主靶細(xì)胞后，病毒RNA利用自身的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成病毒基因組的雙鏈DNA分子。在整合酶的作用下（在細(xì)胞核內(nèi)），雙股DNA整合入宿主細(xì)胞染色體DNA中，這種整合的病毒雙股DNA即稱(chēng)為前病毒。

5HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)抗-HIV初篩試驗(yàn)結(jié)果的解釋和處理抗-HIV陽(yáng)性：極大可能為HIV感染，也可能屬于非特異反應(yīng)抗-HIV弱陽(yáng)性：存在真陽(yáng)性和假陽(yáng)性?xún)煞N可能抗-HIV陰性：極大可能無(wú)HIV感染，不排除陽(yáng)性的可能（存在感染因素下檢測(cè)時(shí)機(jī)不合適）通常的抗-HIV檢測(cè)結(jié)果的處理結(jié)果試劑1試劑2處理意見(jiàn)

A＋＋再次采樣，做確證實(shí)驗(yàn)

B±±或＋再次采樣，做確證實(shí)驗(yàn)

C±－報(bào)告抗-HIV陰性

D－不必復(fù)檢報(bào)告抗-HIV陰性

6HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)疫情報(bào)告*責(zé)任疫情報(bào)告人：《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》及其實(shí)施辦法規(guī)定，執(zhí)行職務(wù)的醫(yī)療保健人員、衛(wèi)生防疫人員是傳染病責(zé)任疫情報(bào)告人。*報(bào)告時(shí)限和方法：責(zé)任疫情報(bào)告人發(fā)現(xiàn)AIDS患者、疑似AIDS患者或無(wú)癥狀HIV感染者時(shí)，城鎮(zhèn)于6小時(shí)內(nèi)、農(nóng)村于12小時(shí)內(nèi)，以最快的通訊方式向當(dāng)?shù)匦l(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)報(bào)告，并同時(shí)報(bào)出傳染病報(bào)告卡。7HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抵抗力HIV一旦離開(kāi)宿主在外界環(huán)境中生存能力便很快消失，HIV對(duì)環(huán)境中的物理因素和化學(xué)因素抵抗力均較弱，比乙肝病毒（HBV）的抵抗力低得多。因此，對(duì)HBV有效的消毒和滅活方法均適用于HIV。8HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抵抗力--物理因素HIV對(duì)熱很敏感，對(duì)低溫的耐受性強(qiáng)于高溫。因此，可以用高溫滅活HIV，在低溫條件下保存HIV。對(duì)紫外線不敏感：用紫外線、γ射線不能滅活HIV。9HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抵抗力--物理因素HIV滅活：美國(guó)疾病控制中心證明，在干燥環(huán)境中的HIV濃度在幾小時(shí)之內(nèi)降低90～99%（即降低1～2log）。在室溫（22～27℃）液體環(huán)境下HIV可存活15天以上；經(jīng)56℃處理30分鐘，可使HIV在體外對(duì)人T淋巴細(xì)胞失去感染性，但不能完全滅活血清中的HIV；血清中HIV經(jīng)過(guò)60℃3小時(shí)或80℃30分鐘作用后不能檢出感染性HIV。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的逆轉(zhuǎn)錄病毒滅活方法是100℃20分鐘。

10HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抵抗力—化學(xué)因素HIV耐堿不耐酸：在pH3.0條件下HIV滴度在10分鐘可下降4個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，而pH值高達(dá)9.0時(shí)，HIV滴度下降甚微。

對(duì)含氯消毒劑敏感。0.5％次氯酸、2％戊二醛溶液、3％碘酒、6％過(guò)氧化氫可在3～5分鐘內(nèi)滅活HIV。11HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)常用的消毒辦法高壓蒸汽滅菌(121℃20分鐘)干烤170℃2小時(shí)煮沸20分鐘消毒劑浸泡30分鐘，常用消毒劑為5％可用氯(次氯酸鈉、次氯酸鉀、氯氨T)、6％過(guò)氧化氫、2％戊二醛等。70%酒精1分鐘可滅活HIV。12HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)13HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV感染實(shí)驗(yàn)室診斷HIV感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法：１、血清學(xué)檢測(cè)２、HIV核酸檢測(cè)３、病毒分離４、CD4T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等目前最常用的方法為HIV特異性抗體的檢測(cè)。14HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本主要為血液，包括血清、血漿和全血；此外還可用唾液檢測(cè)HIV（Orasure，如Salivacard），尿液檢測(cè)HIV抗體。15HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

標(biāo)本的采集、運(yùn)送和處理

①標(biāo)本采集:用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量靜脈血，室溫下自然放置12h，待血液凝固、血塊收縮后再用3、000r/min離心15min，吸出血清備用。用加有抗凝劑的真空采血管（或一次性注射器抽取靜脈血，轉(zhuǎn)移至加有抗凝劑的試管），反復(fù)輕搖，分離血漿和血細(xì)胞備用。用于核酸定性檢測(cè)時(shí)，采集的抗凝全血應(yīng)在48h內(nèi)分離PBMC和血漿，否則應(yīng)在2448h內(nèi)分離血漿和血細(xì)胞。

16HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)采集樣品注意事項(xiàng)采集樣品原則上應(yīng)按臨床采血技術(shù)規(guī)范操作。采集樣品時(shí)應(yīng)注意安全，建議采用真空采血管及蝶形針具，以避免直接接觸血液；直接接觸HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/體液的操作,應(yīng)戴雙層手套。17HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)②標(biāo)本運(yùn)送：運(yùn)送血清或血漿標(biāo)本應(yīng)滅活（56℃30min滅活），用帶蓋的試管?chē)?yán)密封口，試管上應(yīng)標(biāo)明樣品的編號(hào)或受檢者姓名、種類(lèi)和采集時(shí)間。隨樣品應(yīng)附有“送檢單”和“生物樣品檢測(cè)委托書(shū)”，送檢單與生物樣品檢測(cè)委托書(shū)應(yīng)與標(biāo)本分開(kāi)。如果路程較遠(yuǎn)或氣候炎熱，應(yīng)在2-8℃條件下運(yùn)送。用于抗體檢測(cè)的樣品可在短期內(nèi)（≤48小時(shí)）室溫遞送。標(biāo)本應(yīng)專(zhuān)人用送。18HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)用于CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞測(cè)定的樣品應(yīng)在室溫下1823℃運(yùn)送。20HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

應(yīng)采用WHO提出的三級(jí)包裝系統(tǒng)

第一層容器：裝樣品，要求防滲漏。樣品應(yīng)置于帶蓋的試管內(nèi)，試管上應(yīng)有明顯的標(biāo)記，標(biāo)明樣品的編號(hào)或受檢者姓名、種類(lèi)和采集時(shí)間。在試管的周?chē)鷳?yīng)墊有緩沖吸水材料，以免碰碎。隨樣品應(yīng)附有送檢單，送檢單應(yīng)與樣品分開(kāi)放置。第二層容器：要求耐受性好、防滲漏、容納并保護(hù)第一層容器，可以裝若干個(gè)第一層容器。將試管裝入專(zhuān)用帶蓋的容器內(nèi)，容器的材料要易于消毒處理。第三層容器：放在一個(gè)運(yùn)輸用外層包裝內(nèi)，應(yīng)易于消毒。在第三層容器外面要貼標(biāo)簽（數(shù)量，收、發(fā)件人）

21HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)一、血清學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)即抗體、抗原檢測(cè)22HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抗體診斷臨床上實(shí)際應(yīng)用的是測(cè)定特異性HIV抗體，包括初篩和確認(rèn)兩個(gè)方面。HIV抗體一般在感染后幾周逐漸出現(xiàn)，可延續(xù)至終身，是重要診斷依據(jù)，但是從感染到血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)有一段窗口期，平均為1到3個(gè)月，還有一小部分比例的HIV感染者出現(xiàn)遲緩反應(yīng)，95%以上HIV-1感染者產(chǎn)生抗體的時(shí)間是在感染后6個(gè)月以?xún)?nèi)。23HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)抗體檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）斑點(diǎn)免疫試驗(yàn)?zāi)z體金或膠體硒間接免疫熒光（IFAT）24HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抗體檢測(cè)的要點(diǎn)1篩查試驗(yàn)陽(yáng)性不能出陽(yáng)性報(bào)告；2嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）

3嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；4注意防止樣品間交叉污染。25HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抗體檢測(cè)發(fā)展歷史1985年4月首次檢測(cè)HIV-1抗體的ELISA藥盒開(kāi)始供市，不久又建立起WB（免疫印跡法）等確認(rèn)試驗(yàn)。其他技術(shù)如乳膠和明膠顆粒凝集試劑測(cè)定HIV-1抗體的初篩方法也相繼研制成功，這樣不僅提供了HIV/AIDS的臨床診斷依據(jù)，而且明顯地減少了輸血后HIV感染的危險(xiǎn)性。26HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)間接法捕獲法競(jìng)爭(zhēng)法ABS-ELISA法雙抗體夾心法雙抗原夾心法（HIV抗體篩查常用方法）27HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)雙抗原夾心法目前我國(guó)常用的HIV抗體篩查方法是酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)——雙抗原夾心法（第三代試劑）第四代ELISA試劑（線性免疫酶測(cè)定）是最近幾年發(fā)展起來(lái)的HIV抗原抗體聯(lián)合測(cè)定試劑,可同時(shí)檢測(cè)P24抗原和抗HIV-1/2抗體.與第三代抗HIV-1/2試劑相比,檢出時(shí)間提前了4~9.1d.其優(yōu)點(diǎn)在于能同時(shí)檢測(cè)抗原抗體,降低血源篩查的殘余危險(xiǎn)度.28HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)第4代試劑從理論上來(lái)講，這種試劑是很完美的，但其敏感度和特異度尚需通過(guò)大量的臨床評(píng)估加以確認(rèn)。在初篩診斷試劑上還發(fā)展了特異的HIVIgA，用作圍產(chǎn)期兒童診斷，敏感度達(dá)93.1%，特異度在1月齡以上的嬰兒可達(dá)100%。此外，在對(duì)抗HIVIgM的診斷也正在積極研究，并取得了可喜的成績(jī)，無(wú)形中可縮短窗口期7—10天。29HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)雙抗原夾心ELISA試驗(yàn)原理

此類(lèi)試驗(yàn)比較敏感和特異，可檢測(cè)血清中的IgA、IgM、IgG抗體。

將HIV-1/2混合抗原包被在微孔板底部?！耙徊椒ā?-實(shí)驗(yàn)時(shí)加入待檢血清和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記HIV-1/2混合抗原“二步法”--實(shí)驗(yàn)時(shí)先加入待檢血清，溫度處理后，再加酶標(biāo)記HIV-1/2混合抗原30HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

溫度處理后洗滌。待檢血清中如有特異性抗體，即將包被抗原和酶標(biāo)記的抗原橋聯(lián)在一起，如無(wú)抗體，通過(guò)洗板而洗去酶標(biāo)記的混合抗原。加入的底物同被橋聯(lián)抗原上的酶發(fā)生顏色反應(yīng)，指示抗體存在，如無(wú)抗體參與則無(wú)顯色。實(shí)驗(yàn)中設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。31HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)操作方法實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:試驗(yàn)開(kāi)始前將試劑和樣品放置在室溫(18~23℃),按實(shí)驗(yàn)室SOP做好試劑準(zhǔn)備。備好試劑盒、待檢樣品和外部對(duì)照質(zhì)控血清后,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)以及質(zhì)控和安全防護(hù)要求進(jìn)行篩查檢測(cè).32HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)注意事項(xiàng)ELISA是目前公認(rèn)的抗-HIV較佳的篩選方法，但在實(shí)際工作中，ELISA抗-HIV的檢測(cè)受諸多因素影響。１.系統(tǒng)誤差包括試劑盒質(zhì)量問(wèn)題、移液器標(biāo)定與否、酶標(biāo)儀讀數(shù)的準(zhǔn)確性、冰箱、水浴箱溫度的波動(dòng)及環(huán)境溫度等。２.隨機(jī)誤差由于工作人員操作不規(guī)范造成，如加樣不準(zhǔn)甚至漏加或誤加等。33HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)二、膠體金或膠體硒與斑點(diǎn)EIA相似,也是以硝酸纖維膜為載體.區(qū)別在于不用酶標(biāo)記抗體,而代之以紅色的膠體金(或膠體硒)A蛋白,用滲濾法作為洗滌方法.試劑穩(wěn)定,可室溫長(zhǎng)期保存.試驗(yàn)時(shí)不需任何設(shè)備,迅速,簡(jiǎn)便,特異性較好,敏感性約相當(dāng)于中度敏感的ELISA,適用于應(yīng)急檢測(cè),門(mén)診急診個(gè)體檢測(cè).目前有在國(guó)內(nèi)被SFDA批準(zhǔn)注冊(cè)的國(guó)外進(jìn)口試劑和國(guó)內(nèi)產(chǎn)品.一般可在10~30min內(nèi)判讀結(jié)果.34HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)HIV抗體檢測(cè)程序流程圖

標(biāo)本├─選用初篩試劑

初篩檢測(cè)┌────┴───────┐

陽(yáng)性反應(yīng)或可疑陽(yáng)性反應(yīng)

陰性反應(yīng)↓│原用試劑和另一設(shè)計(jì)原理或廠家的初篩│試劑