抗體的檢測和純化培訓課件

抗體的檢測和純化純化步驟2抗體的檢測和純化抗體純化的步驟3抗體的檢測和純化一飽和硫酸銨沉淀法

飽和硫酸氨沉淀是從溶液中分離蛋白質的常用方法。這是一種比較原始，非特異性分離技術。

飽和硫酸氨沉淀法難以得到高純度的抗體。其它大分子蛋白和混入絮狀沉淀中的蛋白會造成對抗體的污染。因此把它作為抗體純化的第一步。4抗體的檢測和純化1，基本原理

高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數小和不易使蛋白質變性而應用最廣。5抗體的檢測和純化2，操作步驟

以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸銨的飽和度也不完全相同。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為

33%—50%（一）配制飽和硫酸銨溶液（

SAS）

1.將

767g（

NH4）

2SO4邊攪拌邊慢慢加到

1升蒸餾水中。用氨水或硫酸調到硫酸pH7.0。此即飽和度為

100%的硫酸銨溶液（

4.1mol/L,25°C）.。

2.其它不同飽和度銨溶液的配制。6抗體的檢測和純化（二）沉淀

1.樣品（如腹水）

20000′g離心

30min，除去細胞碎片；

2.保留上清液并測量體積；

3.邊攪拌邊慢慢加入等體積的

SAS到上清液中，終濃度為

1：

14.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌

6小時或攪拌過夜（

4°C），使蛋白質充分沉淀。7抗體的檢測和純化（三）透析

1.蛋白質溶液

10000′g離心

30min（

4°C）。棄上清保留沉淀；

2.將沉淀溶于少量（

10-20ml）

PBS-0.2g/L疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對PBS-0.2g/L疊氮鈉透析

24-48小時（

4°C），每隔

3-6小時換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨；

3.透析液離心，測定上清液中蛋白質含量。8抗體的檢測和純化ProteinA/G親和層析

親和層析是一種快速有效的生物活性物質的純化方法,它通過偶聯蛋白對目的蛋白選擇性的吸收和分離,可取得較高的純化效果,且操作簡便,廣泛地應用于實驗室抗體純化。由于產品價格昂貴,使用成本較高,限制了它的運用9抗體的檢測和純化ProteinA

A蛋白是金黃色葡萄球菌的表面蛋白,分子量為42KD,有6個不同的IgG結合位點。其中有5個位點對IgG的Fc片段顯示很強的特異性親和力,不同的位點獨立地與抗體結合。但IgA,IgM,IgE也可能結合在配體上,當達到飽和時,一個A蛋白分子至少可以結合兩個IgG分子。A蛋白對IgG有高親和力和特異性,這一特點使之非常適合用于純化腹水或細胞培養(yǎng)上清中的單克隆抗體10抗體的檢測和純化ProteinGG蛋白是一種源自鏈球菌G族的細胞表面蛋白，一種三型Fc受體。其通過類似于A蛋白的非免疫機制與抗體的Fc段結合。像A蛋白一樣，G蛋白與IgG的Fc區(qū)域特異性結合，不同的是，ProteinGSepharose還可以特異性低親和地與重鏈的CH1及輕鏈的Cκ結合而用于純化Fab及F(ab’)2。另外，ProteinG可以廣泛、更強地結合許多類型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同時血清蛋白結合水平更低，純度更高，配體脫落也相對更低。11抗體的檢測和純化ProteinA-SepharoseCL2-4B親和層析柱分離提純IgG

ProteinA--SepharoseCL24B親和層析法的原理是,A蛋白可與IgG上的Fc段特異性地結合,與小鼠IgG的各亞類表現為不同的結合力,結合的強弱程度依次是:IgG2a>IgG2b>IgG3>IgG1。A蛋白的這種結合也是具有pH依賴性的,即可利用改變pH及離子強度,純化與其結合較弱的IgG1。12抗體的檢測和純化方法腹水的處理取腹水,在4℃,12000g條件下離心15min,以除去較大的凝塊。裝柱將1.5gProteinA-SepharoseCL-4B干粉用6～7ml三蒸水溶解,再用0.02M,pH7.4的磷酸鹽緩沖液(上樣緩沖液)浸泡15min,然后裝入層析柱中。平衡用10倍柱床體積的上樣緩沖液過柱,流速為1ml/min,pH試紙測試流出液體的pH為7.4。13抗體的檢測和純化上樣取預處理過的腹水5ml,用上樣緩沖液稀釋至50ml,用0.45μm的濾膜過濾,上樣,流速為1ml/min。洗脫用上樣緩沖液進行流洗,10倍柱床體積,流速為1ml/min。隨后用0.02M,pH4.0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體,同時應用AKTAexplorer100進行監(jiān)測,當觀察到基線開始上升,即出現洗脫峰時,取干凈的4ml離心管收集,每收集3ml后,立即用1M,pH9.0的TRis2Hcl緩沖液調整pH值至7.0。14抗體的檢測和純化平衡收集洗脫液至洗脫峰回到基線后,繼續(xù)用上樣緩沖液平衡5～10倍柱床體積,流速調至1ml/min。再用三蒸水平衡10倍柱床體積。7電泳鑒定

采用SDS不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳(SDS2PAGE),濃縮膠和分離膠濃度分別為120g/L和50g/L,每槽加樣10μl,考馬斯亮藍R250染色。15抗體的檢測和純化層析圖及電泳結果16抗體的檢測和純化MabSelect系列——大規(guī)?？贵w純化親和層析介質MabSelect是一系列最新的大規(guī)模純化抗體的親和層析介質。它們的特點包括：更高的流速和動態(tài)載量

更低的宿主雜蛋白吸附，抗體純度更高更低的蛋白A脫落更易于工藝的線性放大MabSelect易于清洗與除菌，壽命更長、更經濟生產過程無動物血清成分17抗體的檢測和純化精度純化目的：保證最終抗體產品純度，能有效對潛在的污染物，如宿主細胞蛋白(HCP)、免疫球蛋白、宿主DNA；對用于腹水生產抗體的刺激物、內毒素、其它熱原物質、培養(yǎng)液成分、層析凝膠析出成分(脫落的蛋白A配基)進行去除；并能有效的去除/滅活病毒。18抗體的檢測和純化建議的工藝首先采用0.2-0.45m的中空纖維膜技術進行澄清(Cellremoval)；然后用protein-A或protein-B捕獲，酸性條件洗脫后直接pH4.0病毒滅活；澄清過濾后再穿透方式上CaptoAdhere；這一步離子交換之前或之后會有一步20nm納濾去病毒；最后50K膜超濾濃縮和洗濾進行緩沖液置換。有些抗體如果通過優(yōu)化結果不甚滿意，通過增加一步CaptoQ也基本上可以達到要求19抗體的檢測和純化中空纖維膜技術進行澄清對于動物細胞培養(yǎng)液，可以將高密度的培養(yǎng)液直接用中空纖維微濾膜(0.22或0.45m)進行澄清，而無需事先經過離心和預過濾，步驟少，速度快，收率高，成本低。和離心機比較，具有極高的澄清度，因此中空纖維澄清后的細胞培養(yǎng)液可直接進蛋白A親和層析進行純化。20抗體的檢測和純化層析精細純化技術：目的：去除特定的雜質，如HCP、DNA、聚集體和變體等。常用的層析技術：CaptoAdhere、離子交換、疏水層析等。21抗體的檢測和純化CaptoAdhere

目的：使抗體分子流穿而聚集體、宿主蛋白、脫落的蛋白A配基等雜質結合在Adhere柱上加以去除去。原理：CaptoAdhere介質專為治療用抗體的分離純化而設計，其配基(N-Benzyl-N-methylethanolamine）綜合了陰離子交換、氫鍵和疏水等多種復雜的作用方式，因此對于抗體的聚集體具有非常獨特而高效的去除能力；此外，通過有效的實驗設計(DesignofExperiment，DoE)，CaptoAdhere介質還可以同時有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主蛋白、核酸、內毒素和潛在的病毒，并使得結合MabSelectSuRe的抗體的兩步層析純化工藝成為現實步驟：首先，需要優(yōu)化抗體在CaptoAdhere上的結合條件。（確定的主要影響因素和實驗設計范圍為：電導：2-15mS/cm，每毫升凝膠上樣載量為75-300mg/ml(流穿模式)，pH范圍需要做起始結合條件確定：通常在低電導條件下(如2mS/cm時)樣品完全不結合到有少量樣品結合的pH條件）22抗體的檢測和純化CaptoAdhere其次（HTPDPredictor）：確定好實驗條件后，可以同時平行做所有不同的結合條件，將試驗結果相應于響應因子進行統計學分析合并分析結果可以得到滿足實驗目標的操作范圍。結果和優(yōu)勢：流穿模式的CaptoAdhere將宿主蛋白、脫落的蛋白A和聚集體降低到很低的水平，載量可達100-200mg/ml介質，單步收率>90%。此外，CaptoAdhere還具有很強的病毒去除的能力，如MVM病毒的去除能力可達5.9個Log。。23抗體的檢測和純化將MabselectSuRe和CaptoAdhere相結合進行兩步層析純化。MabselectSuRe可以達到>99%的抗體純度，親和洗脫峰使用Captoadhere的流穿模式進行精純:使抗體分子流穿而聚集體、宿主蛋白、脫落的蛋白A配基等雜質結合在Adhere柱上加以去除。這樣僅用兩步層析就可以得到符合藥用級質量要求的高純度抗體產品，大大縮短了工藝時間，提高生產效率，同時增加了收率，降低了生產成本。兩步層析工藝24抗體的檢測和純化

完善工藝整合中的其它問題1，核酸和內毒素的去除。2，脫落親和配基(蛋白A)的去除。a,陰離子交換層析是去除蛋白A-IgG復合物。b,陽離子交換層析也可以去除蛋白A配基。3,抗體制品的病毒去除/滅活及驗證。低pH孵育、加熱、S/D(溶劑/去污劑)、納濾等25抗體的檢測和純化1，核酸和內毒素的去除。26抗體的檢測和純化2，脫落親和配基(蛋白A)的去除。a,陰離子交換層析是去除蛋白A-IgG復合物。b,陽離子交換層析也可以去除蛋白A配基。3,抗體制品的病毒去除/滅活及驗證。低pH孵育、加熱、S/D(溶劑/去污劑)、納濾等27抗體的檢測和純化特異雜質含量驗證DNA含量：DNA分子雜交法測定。（<100pg/一劑量）熱原（內毒素）：家兔法等試劑。（<5EU/Kg）病毒含量：Scale-down。（工藝除病毒能力需達到10log以上）28抗體的檢測和純化單克隆抗體的濃縮目的方法：凍融濃縮法原理：凍融處理后的樣品，其溶質集中在濃縮管的下端，越近管底濃度越高29抗體的檢測和純化ELISA------

徐順

胡堅

李靜一30抗體的檢測和純化1.

ELISA的原理2.

ELISA的類型3.試劑準備：免疫吸附劑結合物酶底物的準備4.對照設定5.標本的采取和保存6.結果判斷

31抗體的檢測和純化ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)是一種免疫測定試驗。

基礎:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，由此進行定性或定量分析。1.

ELISA的原理32抗體的檢測和純化酶免疫測定類型

這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯免疫吸附劑測定，簡稱ELISA。酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定33抗體的檢測和純化1.1抗原抗體反應

1.1.1可逆性

抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab

抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性。34抗體的檢測和純化1.1.2特異性

抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間?；瘜W結構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。

測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。

35抗體的檢測和純化1.1.3最適比例

36抗體的檢測和純化1.1.4敏感性化學比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應測定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿標記的免疫敏感度可提高數千倍，達ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。37抗體的檢測和純化2.1雙抗原夾心法測抗體

用特異性抗原進行包被和制備酶結合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。2

ELISA的類型38抗體的檢測和純化2.2間接法測抗體

傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。39抗體的檢測和純化2.3競爭法測抗體

當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。

40抗體的檢測和純化2.4捕獲包被法測抗體IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。41抗體的檢測和純化3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液42抗體的檢測和純化ELISA的試劑準備A

固相載體聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。43抗體的檢測和純化44抗體的檢測和純化3.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。

蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。45抗體的檢測和純化46抗體的檢測和純化3.1.3包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯結發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。47抗體的檢測和純化3.1.4包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2的磷酸鹽緩沖液

pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。48抗體的檢測和純化3.1.5封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉？49抗體的檢測和純化3.1.6洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。50抗體的檢測和純化

ELISA的試劑準備B

3.2結合物

即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關鍵的試劑

1酶的催化活性

2抗體（或抗原）的免疫活性

3含有或少含有游離的抗體（或抗原）

4結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。51抗體的檢測和純化52抗體的檢測和純化3.2.1結合物用的抗原和抗體

制備結合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯結時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。53抗體的檢測和純化3.2.2酶純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。54抗體的檢測和純化3.2.3結合物的制備酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。有效（結合率達60%-70%）和重復性好。交聯反應是隨機的，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。（2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成chiff氏堿而結合。簡便有效.55抗體的檢測和純化

結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。制得結合物，最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。56抗體的檢測和純化3.2.4結合物的保存

酶和抗體均為生物活性物質，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉）。57抗體的檢測和純化3.2.5結合物的稀釋液

用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。58抗體的檢測和純化試劑準備

C酶的底物59抗體的檢測和純化60抗體的檢測和純化3.3酶的底物3.3.1

HRP的底物OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)和ABTS。E61抗體的檢測和純化TMB經HRP作用后共產物顯藍色。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液。酶反應終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。62抗體的檢測和純化3.5酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。64抗體的檢測和純化4對照設定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。 陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。 加入的量應與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質的量。65抗體的檢測和純化參考標準品

定量測定（如甲胎蛋白質，癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中.

陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。66抗體的檢測和純化5標本的采取和保存

體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以