DNA提取的基本步驟課件

DNA提取的基本步驟I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中DNA提取的基本步驟I.材料準備1DNA提取的基本步驟I.材料準備DNA提取的基本步驟I.材料材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融基因2材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融基因細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低基3細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低基核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)4核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：5核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：5多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化多糖的去除：核酸分離、純化6多糖的去除：核酸分離、純化多糖的去除：核酸分離、純化6多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌多酚的去除：核酸分離、純化鹽離子的去除：7多酚的去除：核酸分離、純化鹽離子的去除：多酚的去除：核酸分離核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉8核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ逥NA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)重新純化DNA，去除蛋白、9DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)重新純化DNA，去除蛋白、材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。對策

原因材料不新鮮或反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融10材料不新鮮或反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。對策

原因?qū)嶒灢牧喜患鸦蛄可俦M量選用新鮮（幼嫩）的材料DNA提取常見問11實驗材料不佳或量少盡量選用新鮮（幼嫩）的材料DNA提取常見問PCR標準反應(yīng)體系DNA模板引物反應(yīng)緩沖液dNTPddH2O耐熱聚合酶PCR標準反應(yīng)體系12PCR標準反應(yīng)體系PCR標準反應(yīng)體系12反應(yīng)體系對PCR擴增的影響DNA模板純度

蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)完整性

模板降解會導(dǎo)致PCR擴增無產(chǎn)物濃度加量過多導(dǎo)致非特異性擴增增加特異性

長度適當、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性避免反復(fù)凍融濃度應(yīng)適當,過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則引物擴增產(chǎn)物太少反應(yīng)體系對PCR擴增的影響DNA模板純度蛋白、多糖、酚類等13反應(yīng)體系對PCR擴增的影響DNA模板純度蛋白、多糖、酚類等反應(yīng)體系對PCR擴增的影響反應(yīng)Buffer

pH值,鹽離子濃度穩(wěn)定劑,增強劑Mg2＋濃度過高非特異性嚴重過低無擴增產(chǎn)物dNTPMixture濃度適當避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當避免污染反應(yīng)體系對PCR擴增的影響反應(yīng)BufferpH值,鹽離子濃14反應(yīng)體系對PCR擴增的影響反應(yīng)BufferpH值,鹽離子濃PCR

MasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液dNTPPCR增強劑

PCRMasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液15PCRMasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液PCRPCR

MasterMix特點

快速簡便減少加樣誤差和污染

靈敏度高可擴增低至2個拷貝的目的模板

特異性強降低PCR反應(yīng)的要求，增強特異性

穩(wěn)定性好長期放置活性無改變PCRMasterMix特點快速簡便減少加樣16PCRMasterMix特點快速簡便減少加樣PCR常見問題無擴增產(chǎn)物非特異性擴增拖尾假陽性PCR常見問題無擴增產(chǎn)物非特異性擴增拖尾假陽性17PCR常見問題無擴增產(chǎn)物非特異性擴增拖尾假陽性PCRPCR常見問題之一無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計引物,或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；PCR常見問題之一無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低原因?qū)?8PCR常見問題之一無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低原因?qū)CR常見問題之二

非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。PCR常見問題之二非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條19PCR常見問題之二非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條PCR常見問題之二引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

非特異性擴增PCR常見問題之二引物特異性差原因?qū)χ匦略O(shè)計引物或者使用巢20PCR常見問題之二引物特異性差原因?qū)χ匦略O(shè)計引物或者使用巢PCR常見問題之三

拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。M12PCR常見問題之三拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)21PCR常見問題之三拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)PCR常見問題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

拖尾PCR常見問題之三模板不純原因?qū)兓０逋衔?2PCR常見問題之三模板不純原因?qū)兓０逋衔睵CR常見問PCR常見問題之四假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況)原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物

對策：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。PCR常見問題之四假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況)23PCR常見問題之四假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況)謝謝！謝謝！24謝謝！謝謝！24酚/氯仿/異戊醇的作用：酚可以使蛋白質(zhì)變性，作用大于氯仿，但水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收。還有，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應(yīng)不能正常進行。異戊醇的添加，主要可以使離心后上下層的界面更加清晰，方便水相的回收。酚/氯仿/異戊醇酚/氯仿/異戊醇的作用：酚可以使蛋白質(zhì)變性，作用大于氯仿，但25酚/氯仿/異戊醇的作用：酚可以使蛋白質(zhì)變性，作用大于氯仿，但Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=T26Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=T標準的PCR反應(yīng)體系：

10×擴增緩沖液

10ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶

2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至

100ul

10×擴增緩沖液

2.5ul

4種dNTP混合物

各50umol/L

引物

各2.5～25pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶

0.6u

Mg2+

0.4mmol/L

加雙或三蒸水至

25ul

標準的PCR反應(yīng)體系：

10×擴增緩沖液27標準的PCR反應(yīng)體系：

10×擴增緩沖液DNA提取的基本步驟I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中DNA提取的基本步驟I.材料準備28DNA提取的基本步驟I.材料準備DNA提取的基本步驟I.材料材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融基因29材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融基因細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低基30細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低基核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)31核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：32核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：32多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化多糖的去除：核酸分離、純化33多糖的去除：核酸分離、純化多糖的去除：核酸分離、純化33多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌多酚的去除：核酸分離、純化鹽離子的去除：34多酚的去除：核酸分離、純化鹽離子的去除：多酚的去除：核酸分離核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉35核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ逥NA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)重新純化DNA，去除蛋白、36DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)重新純化DNA，去除蛋白、材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。對策

原因材料不新鮮或反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融37材料不新鮮或反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。對策

原因?qū)嶒灢牧喜患鸦蛄可俦M量選用新鮮（幼嫩）的材料DNA提取常見問38實驗材料不佳或量少盡量選用新鮮（幼嫩）的材料DNA提取常見問PCR標準反應(yīng)體系DNA模板引物反應(yīng)緩沖液dNTPddH2O耐熱聚合酶PCR標準反應(yīng)體系39PCR標準反應(yīng)體系PCR標準反應(yīng)體系39反應(yīng)體系對PCR擴增的影響DNA模板純度

蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)完整性

模板降解會導(dǎo)致PCR擴增無產(chǎn)物濃度加量過多導(dǎo)致非特異性擴增增加特異性

長度適當、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性避免反復(fù)凍融濃度應(yīng)適當,過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則引物擴增產(chǎn)物太少反應(yīng)體系對PCR擴增的影響DNA模板純度蛋白、多糖、酚類等40反應(yīng)體系對PCR擴增的影響DNA模板純度蛋白、多糖、酚類等反應(yīng)體系對PCR擴增的影響反應(yīng)Buffer

pH值,鹽離子濃度穩(wěn)定劑,增強劑Mg2＋濃度過高非特異性嚴重過低無擴增產(chǎn)物dNTPMixture濃度適當避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當避免污染反應(yīng)體系對PCR擴增的影響反應(yīng)BufferpH值,鹽離子濃41反應(yīng)體系對PCR擴增的影響反應(yīng)BufferpH值,鹽離子濃PCR

MasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液dNTPPCR增強劑

PCRMasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液42PCRMasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液PCRPCR

MasterMix特點

快速簡便減少加樣誤差和污染

靈敏度高可擴增低至2個拷貝的目的模板

特異性強降低PCR反應(yīng)的要求，增強特異性

穩(wěn)定性好長期放置活性無改變PCRMasterMix特點快速簡便減少加樣43PCRMasterMix特點快速簡便減少加樣PCR常見問題無擴增產(chǎn)物非特異性擴增拖尾假陽性PCR常見問題無擴增產(chǎn)物非特異性擴增拖尾假陽性44PCR常見問題無擴增產(chǎn)物非特異性擴增拖尾假陽性PCRPCR常見問題之一無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計引物,或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；PCR常見問題之一無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低原因?qū)?5PCR常見問題之一無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低原因?qū)CR常見問題之二

非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。PCR常見問題之二非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條46PCR常見問題之二非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條PCR常見問題之二引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

非特異性擴增PCR常見問題之二引物特異性差原因?qū)χ匦略O(shè)計引物或者使用巢47PCR常見問題之二引物特異性差原因?qū)χ匦略O(shè)計引物或者使用巢PCR常見問題之三

拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。M12PCR常見問題之三拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)48PCR常見問題之三拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)PCR常見問題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

拖尾PCR常見問題之三模板不純原因?qū)兓０逋衔?9PCR常見問題之三模板不純原因?qū)兓０逋衔睵CR常見問PCR常見問題之四假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況)原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物

對策：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。PCR常見問題之四假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況)50PCR常見問題之四假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況)謝謝！謝謝！51謝謝