實驗五過氧化物同工酶PAGE分析

實驗五過氧化物同工酶PAGE分析第1頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月一、目的掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)的原理和操作方法掌握PAGE法分離過氧化物同工酶的原理和方法第2頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月二、原理聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）過氧化物同工酶及活性染色第3頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）P201.電泳概念電泳：帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象?！稹稹稹稹?+-+-第4頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）2.電泳分類顯微電泳自由界面電泳區(qū)帶電泳紙電泳醋酸薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第5頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）3.電泳法原理在一定條件下，任何帶點顆粒都有自己特定的電泳遷移率。影響電泳遷移率的因素：顆粒性質(zhì)：凈電荷數(shù)目顆粒大小顆粒形狀電場強度：V/cm溶液性質(zhì)：緩沖液的pH離子強度溶液黏度電滲：液體對固體支持物的相對移動第6頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化劑過硫酸銨（AP）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）4.聚丙烯酰胺凝膠電泳第7頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)過程TEMED催化AP生成硫酸自由基S2O82－2SO4·ˉ硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長鏈：第8頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：第9頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月PAGE法分離蛋白質(zhì)的三種效應(yīng)電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，在同一電場中泳動率不同；分子篩效應(yīng)；蛋白質(zhì)分子大小和形狀各不相同，在通過一定濃度（一定孔徑）凝膠時受阻力各不相同，泳動率也不相同；濃縮效應(yīng)：凝膠為不連續(xù)系統(tǒng)（凝膠層、pH、電位梯度均不連續(xù)），從而使樣品濃縮在一個極窄的起始區(qū)帶，即所謂濃縮效應(yīng)，提高了條帶分辯率。（只有不連續(xù)凝膠具有此效應(yīng)）第10頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）過氧化物同工酶及其活性染色（P98）同工酶是指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)不同的一組酶。同功酶是機體調(diào)節(jié)酶活性的一種方式，在各種生物體中廣泛存在。過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。因此，測定這種酶的活性或其同工酶的變化情況，可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化。第12頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月本實驗采用PAGE技術(shù)，分離小麥幼苗過氧化物酶同工酶，根據(jù)酶的生物化學(xué)反應(yīng)，通過染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶，以鑒定小麥幼苗過氧化物酶同工酶。過氧化物+過氧化物酶→復(fù)合物復(fù)合物+DH2→過氧化物酶+H2O+DH2O2聯(lián)苯胺棕色物質(zhì)（二）過氧化物同工酶及其活性染色（P98）第13頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月三、材料、儀器和試劑材料：小麥幼苗儀器：電泳儀、電泳槽、高速離心機、量筒、燒杯、微量注射器、研缽、染色盒第14頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月三、材料、儀器和試劑試劑：A液：30%Acr-0.8%BisB液：Tris+EDTAC液：TEMEDD液：10%AP電極緩沖液：硼酸鈉-硼酸（pH8.3）0.5%溴酚藍染色液：0.1%聯(lián)苯胺樣品提取液：pH8.0Tris-HCl緩沖液40%蔗糖溶液第15頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、操作步驟凝膠制備聚丙烯酰胺凝膠配方

成分含量作用A液（30%Acr-0.8%Bis）2.65mL交聯(lián)劑B液（Tris+EDTA）4.75mL緩沖液C液（TEMED）10μL加速劑D液（10%AP）50μL催化劑第16頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、操作步驟樣品制備稱取小麥幼苗葉片0.5克，放入研缽內(nèi)，加pH8.0樣品提取液1mL，于冰浴中研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，在高速離心機上以8000rpm離心10分鐘，倒出上清液，以等量40%蔗糖混合，并加2滴溴酚藍，即為樣品液。第17頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、操作步驟裝槽、上樣

30-50μL第18頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、操作步驟電泳接好電源線(上槽接負極，下槽接正極)。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓，以10V/cm穩(wěn)定電壓電泳，待前沿指示染料溴酚藍下行至距膠板末端1-2厘米處，即可停止電泳。第19頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、操作步驟剝膠、染色電泳結(jié)束之后，將垂直板從電泳槽上取下，小心地將兩塊玻璃板分開，并小心地將凝膠置于染色盒中，進行染色反應(yīng)，染色10min，用蒸餾水漂洗1-2次。