血液細(xì)胞組織化學(xué)培訓(xùn)課件

血液細(xì)胞組織化學(xué)概述

細(xì)胞化學(xué)染色是在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個學(xué)科分支，是細(xì)胞學(xué)與化學(xué)相結(jié)合而形成的一門科學(xué)，研究細(xì)胞的化學(xué)成分，在保存血液細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)上，在細(xì)胞原位顯示化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的原理，研究細(xì)胞成分的化學(xué)性質(zhì)。

2血液細(xì)胞組織化學(xué)研究目的及臨床應(yīng)用

研究正常血液細(xì)胞的活動與生理功能提高血液病的診斷和鑒別診斷水平

確定急性白血病的類型

有助于某些血液病的鑒別診斷觀察療效和估計預(yù)后

探索某些血液病的發(fā)病原理及治療機制

3血液細(xì)胞組織化學(xué)標(biāo)本的選擇

BM片、血片、淋巴結(jié)印片、脾印片等均可作組化染色。用于酶染色的標(biāo)本應(yīng)盡可能新鮮。用于非酶染色的標(biāo)本可在室溫下放置1個月，如PAS標(biāo)本。

4血液細(xì)胞組織化學(xué)固定的目的及方法

目的保持細(xì)胞生前的結(jié)構(gòu)與化學(xué)成分，并使血膜在染色、沖洗過程中不易脫落損壞。常用化學(xué)固定方法

甲醛蒸汽固定：將濾紙平鋪于染色缸底部，加入少許40%甲醛溶液。將涂片標(biāo)本放入缸內(nèi)，加蓋使甲醛蒸汽固定血膜5-10分鐘，水洗后晾干。液體固定：常用的固定液為乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用兩種或兩種以上成分組成混合固定液。

5血液細(xì)胞組織化學(xué)顯示方法

純化學(xué)方法

金屬沉淀法

偶氮偶聯(lián)法

聯(lián)苯胺色素法

Schiff反應(yīng)

普魯士藍(lán)反應(yīng)類化學(xué)方法

物理學(xué)方法6血液細(xì)胞組織化學(xué)復(fù)染方法

復(fù)染是細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分顯色后，為了便于觀察而進行的對比染色方法。

細(xì)胞核復(fù)染法：常用染料為蘇木精、甲基綠、核固紅、沙黃等。

細(xì)胞漿復(fù)染法：常用染料為伊紅、光綠等7血液細(xì)胞組織化學(xué)過氧化物酶染色（Peroxidasestain,POX）8血液細(xì)胞組織化學(xué)目的急性白血病的鑒別診斷AML：陽性ALL：陰性9血液細(xì)胞組織化學(xué)分布特點-1原粒細(xì)胞：陰性，白血病副原粒細(xì)胞可呈陽性反應(yīng)。中性粒細(xì)胞：自早幼粒細(xì)胞起隨細(xì)胞成熟陽性強度遞增。陽性顆粒圓形，規(guī)則，直徑與嗜蘇丹黑顆粒相仿，比瑞氏染色特殊顆粒大。嗜酸粒細(xì)胞：陽性反應(yīng)，顆粒比中性粒細(xì)胞的大，著色深。嗜堿粒細(xì)胞：陰性反應(yīng)，在CML時可出現(xiàn)陽性反應(yīng)。10血液細(xì)胞組織化學(xué)分布特點-2在粒細(xì)胞系統(tǒng)中，過氧化物酶顆粒的出現(xiàn)和增多與特殊顆粒的出現(xiàn)和增多有平行關(guān)系。單核細(xì)胞系：原單呈陰性反應(yīng)，幼單和單核細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)。陽性顆粒少而細(xì)小，彌散分布，有的也可呈陰性反應(yīng)。其他細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、幼紅細(xì)胞、漿細(xì)胞和組織細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。有的吞噬細(xì)胞可呈陽性反應(yīng)11血液細(xì)胞組織化學(xué)12血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑配制0.3%聯(lián)苯胺酒精溶液：

聯(lián)苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亞硝基鐵氰化鈉飽和水溶液1ml?？杀４?-2年。

過氧化氫溶液配制：

3%過氧化氫1滴+蒸餾水5ml，須每次用時新鮮配制。

13血液細(xì)胞組織化學(xué)染色步驟于新鮮涂片上滴加復(fù)方聯(lián)苯胺染液3－8滴，使涂片蓋滿。1－2分鐘后加入等量過氧化氫溶液。4－8分鐘后用水沖洗，空氣中晾干。用瑞氏染液復(fù)染，涼干后油鏡觀察。14血液細(xì)胞組織化學(xué)染色原理

粒細(xì)胞及部分單核細(xì)胞胞漿內(nèi)的顆粒中含有過氧化物酶，該酶能分解過氧化氫，釋放出新生態(tài)的氧。從而使無色的聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)。聯(lián)苯胺藍(lán)是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，它可進一步氧化變成棕色的化合物

15血液細(xì)胞組織化學(xué)結(jié)果判斷陽性反應(yīng)為藍(lán)色或藍(lán)棕色顆粒，定位于胞漿中。16血液細(xì)胞組織化學(xué)臨床意義ALL時，原始細(xì)胞的POX陽性小于3%。AML時，原始細(xì)胞的陽性≥3%。在多數(shù)的M1、絕大部分M2和M3中，原始細(xì)胞的陽性率大于85%。M4和M5時，原單有時可呈弱陽性，但絕大多數(shù)的原單是POX陰性。M6，原粒和幼稚粒細(xì)胞是POX陽性，幼紅細(xì)胞是POX陰性。在M7，血小板POX的活性只能在超微結(jié)構(gòu)上證實。MDS時，粒細(xì)胞白血病和感染所致的WBC增高時，成熟中性粒細(xì)胞的POX活性可能降低或消失。CML時，成熟中性粒細(xì)胞的POX活性增強。17血液細(xì)胞組織化學(xué)注意事項

已固定的血膜因為酶已破壞不能再作過氧化物酶染色。所用過氧化氫必須新鮮，加于血膜上應(yīng)能發(fā)生泡沫。過量時紅細(xì)胞可出現(xiàn)假陽性。過氧化氫的濃度要適當(dāng)加減，過量則顆粒色深，不足則顆粒色淡。滴加過氧化氫液之后，最好將染片置于載物臺上，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)胞漿出現(xiàn)陽性顆粒時，立即水洗。18血液細(xì)胞組織化學(xué)19血液細(xì)胞組織化學(xué)

糖原染色

（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）20血液細(xì)胞組織化學(xué)目的

紅白血?。?+++）與巨幼紅細(xì)胞貧血（-）的鑒別診斷MDS與巨幼紅細(xì)胞貧血（-）的鑒別診斷單核細(xì)胞白血?。?）與組織細(xì)胞病（MH）的鑒別診斷淋巴肉瘤、何杰金病與急性淋巴細(xì)胞白血病的鑒別診斷高歇病與尼曼-匹克病的鑒別診斷

以上都是前者增高，后者降低或陰性。

21血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑-110g/L過碘酸液Schiff染液：堿性品紅0.5gDH2O100mlDH2O煮沸后待片刻，加入堿性品紅，振蕩數(shù)分鐘使品紅溶解，冷至50℃加入1M的鹽酸20ml，混勻。待冷卻至25℃加入偏重亞硫酸鈉0.5g，混合，置于帶塞的棕色瓶中，放于暗處24小時。染液為無色，如為微紅則加活性炭1－2g，混合過濾，如過濾液仍有紅色，應(yīng)再加少許活性炭，至紅色完全被吸收為止。制成后置于棕色瓶內(nèi)保存在冰箱備用，如變?yōu)榧t色，則不能使用。

22血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑-2

蘇木素液：蘇木素0.9g95％乙醇10ml銨（鉀）明礬20gDH2O200ml將蘇木素溶于95％的乙醇，鉀明礬溶于水（可加熱），然后將蘇木素液加入明礬液中混合，用強火煮沸后加氧化汞0.5g，迅速攪拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日過濾，臨用時取此液95ml加冰醋酸5ml，可使細(xì)胞著色清楚。

23血液細(xì)胞組織化學(xué)染色步驟

將新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10分鐘。10g/L過碘酸液作用20分鐘DH2O洗滌1分鐘，晾干Schiff染液，60分鐘用自來水洗滌15分鐘（細(xì)水長流沖洗）蘇木素染液10分鐘。自來水沖洗15分鐘，待干鏡檢。

24血液細(xì)胞組織化學(xué)染色原理

過碘酸能使細(xì)胞內(nèi)的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Schiff氏液的無色品紅結(jié)合，呈紅色，定位于胞漿上。

25血液細(xì)胞組織化學(xué)結(jié)果判斷

正常BM：有核紅細(xì)胞幾乎均呈陰性反應(yīng)，在AML－M6，幼紅細(xì)胞為PAS強陽性。中性粒細(xì)胞：原粒細(xì)胞多為陰性，早幼粒階段開始呈PAS陽性，其后各階段陽性逐漸增強。巨核細(xì)胞和血小板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核細(xì)胞為細(xì)小彌散的陽性，PLT為粉紅色。ALL：可以是密集粗塊狀的顆粒，也能是細(xì)小彌散的顆粒，或是這兩種顆粒的混合。ALL的PAS也可能為陰性，特別是L3時。單核細(xì)胞白血病，原單細(xì)胞常為陰性，幼單和成熟單可有弱陽性或彌散陽性。

26血液細(xì)胞組織化學(xué)注意事項

1）

Schiff液變紅不能再用。2）

堿性品紅的質(zhì)量很重要，如堿性品紅不合格，加活性炭，顏色也不被吸附。如無蘇木精復(fù)染液，可用1%甲綠復(fù)染25分替代。

27血液細(xì)胞組織化學(xué)28血液細(xì)胞組織化學(xué)29血液細(xì)胞組織化學(xué)30血液細(xì)胞組織化學(xué)非特異性酯酶染色31血液細(xì)胞組織化學(xué)原理

非特異性酯酶是作用于短鏈脂肪的酶，當(dāng)酯酶活性存在時，水解基質(zhì)中的α－醋酸萘酚，與重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的有機產(chǎn)物，定位于胞漿上。32血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑甲醛：基質(zhì)液：1/15M的磷酸緩沖液PH7.440ml10g/Lα－醋酸萘酚50％丙酮液0.8ml重氮鹽（DiazoblueB）40mg33血液細(xì)胞組織化學(xué)方法

新鮮涂片用甲醛蒸汽固定5分鐘。流水沖洗5分鐘，晾干。置于基質(zhì)液中37℃1小時，水洗泡10分鐘。20g/L甲綠復(fù)染20－30分鐘。水洗，晾干，鏡檢。34血液細(xì)胞組織化學(xué)臨床意義

單核細(xì)胞系統(tǒng)呈陽性，伴隨著細(xì)胞的成熟而加強，對AL有鑒別診斷作用。35血液細(xì)胞組織化學(xué)非特異性酯酶-氟化鈉抑制試驗同非特異性酯酶，只是在1ml作用液中，加入1.5mg氟化鈉，即可抑制單核細(xì)胞的酯酶，故可作急性單核細(xì)胞白血病的鑒別診斷。

36血液細(xì)胞組織化學(xué)37血液細(xì)胞組織化學(xué)38血液細(xì)胞組織化學(xué)39血液細(xì)胞組織化學(xué)急性白血病中的組化染色

白血病POXNSEPASALL

—+

+AML

M0+——

M1+(>3原始細(xì)胞)——

M2++——

M3++++—

M4++（原單細(xì)胞）—

M5—/+++—/+

M6+（原粒細(xì)胞）—+（幼紅細(xì)胞）

M7—++40血液細(xì)胞組織化學(xué)

中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（AKP）

41血液細(xì)胞組織化學(xué)目的鑒別白血?。ǖ停┖桶籽樱ǜ撸┓磻?yīng)鑒別淋巴肉瘤（高）和何杰金病鑒別細(xì)菌性感染（高）與病毒性感染

42血液細(xì)胞組織化學(xué)分布

血細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，主要見于成熟的中性粒細(xì)胞，定位于胞漿中。

43血液細(xì)胞組織化學(xué)原理

細(xì)胞中的AKP在PH9.5－9.6緩沖液中能使基質(zhì)中的磷酸萘酚鈉水解，釋放出萘酚。后者與一種穩(wěn)定的重氮鹽（常用有固紫Fast--Garnet，GBC或固藍(lán)RR）偶聯(lián)，生成不溶性的偶氮染料，沉積于細(xì)胞上。

44血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑

95%乙醇固醬紫GBCAS-BI磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml0.2Mtris緩沖液：三羥甲基氨基甲烷2.43g+DH2O溶至100ml。0.05Mtris緩沖液（PH8.6-9.0）：0.2Mtris緩沖液25ml+0.1MHCL49ml貯存液：50mlAS-BI磷酸萘酚+PH8.80.05Mtris緩沖液50ml混勻，冰箱保存1%甲基綠

45血液細(xì)胞組織化學(xué)染色步驟

新鮮BM片及血片待干95%乙醇固定10分鐘固醬紫1mg+2ml貯存液混勻，立即滴加數(shù)滴在血片或BM片上，置37℃孵箱孵育30分鐘用蒸餾水快沖

放入1%甲綠中復(fù)染5分鐘用蒸餾水快沖，待干，鏡檢

46血液細(xì)胞組織化學(xué)結(jié)果判斷

陽性顆粒呈紅色，定位于成熟中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)。

計數(shù)方法，按堿酶活性強弱，分為0-4+共5級。分?jǐn)?shù)特點0胞漿內(nèi)無紅色的顆粒1彌散的紅色，偶見顆粒2彌散的紅色，有中等量的顆粒3顯著的紅色，有較多的顆粒4顯著的紅色，有充滿胞漿的粗大顆粒47血液細(xì)胞組織化學(xué)計算積分分?jǐn)?shù)細(xì)胞數(shù)目積分0200145452255035154520總數(shù)100130=LAP積分

48血液細(xì)胞組織化學(xué)50血液細(xì)胞組織化學(xué)鐵粒染色51血液細(xì)胞組織化學(xué)原理

骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細(xì)胞外鐵，其中的三價鐵與分子中的蛋白質(zhì)結(jié)合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離出來，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍(lán)反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應(yīng)的強弱了解骨髓中鐵的含量。

52血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑

酸性亞鐵氰化鉀溶液：200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份取200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩緩加入濃鹽酸，邊滴加邊搖勻，至出現(xiàn)白色沉淀，再滴加200g/L亞鐵氰化鉀，邊滴加邊搖勻，至白色沉淀消失為止，備用。2g/L核固紅－硫酸鋁溶液：取硫酸鋁10g加入100mlDH2O再加入核固紅EMER出品0.2g，置于37℃水浴中1小時，并經(jīng)常振蕩，使溶解，過濾后使用。53血液細(xì)胞組織化學(xué)方法選骨髓小粒豐富的骨髓涂片玻片上滴加酸性亞鐵氰化鉀，染色30分鐘。（可置于37℃）用DH2O沖洗后用核固紅染液復(fù)染10－15分鐘。流水沖洗，晾干，油鏡檢查。54血液細(xì)胞組織化學(xué)結(jié)果

正常人細(xì)胞外鐵：＋－＋＋幼紅細(xì)胞呈鮮紅色，胞漿成淡黃紅色，鐵粒呈藍(lán)綠色。細(xì)胞外鐵的判斷用低倍鏡觀察涂片，特別時涂片尾部和骨髓小粒附近。5