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文檔簡(jiǎn)介
血液細(xì)胞組織化學(xué)概述
細(xì)胞化學(xué)染色是在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一個(gè)學(xué)科分支,是細(xì)胞學(xué)與化學(xué)相結(jié)合而形成的一門科學(xué),研究細(xì)胞的化學(xué)成分,在保存血液細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)上,在細(xì)胞原位顯示化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果,根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的原理,研究細(xì)胞成分的化學(xué)性質(zhì)。
2血液細(xì)胞組織化學(xué)研究目的及臨床應(yīng)用
研究正常血液細(xì)胞的活動(dòng)與生理功能提高血液病的診斷和鑒別診斷水平
確定急性白血病的類型
有助于某些血液病的鑒別診斷觀察療效和估計(jì)預(yù)后
探索某些血液病的發(fā)病原理及治療機(jī)制
3血液細(xì)胞組織化學(xué)標(biāo)本的選擇
BM片、血片、淋巴結(jié)印片、脾印片等均可作組化染色。用于酶染色的標(biāo)本應(yīng)盡可能新鮮。用于非酶染色的標(biāo)本可在室溫下放置1個(gè)月,如PAS標(biāo)本。
4血液細(xì)胞組織化學(xué)固定的目的及方法
目的保持細(xì)胞生前的結(jié)構(gòu)與化學(xué)成分,并使血膜在染色、沖洗過(guò)程中不易脫落損壞。常用化學(xué)固定方法
甲醛蒸汽固定:將濾紙平鋪于染色缸底部,加入少許40%甲醛溶液。將涂片標(biāo)本放入缸內(nèi),加蓋使甲醛蒸汽固定血膜5-10分鐘,水洗后晾干。液體固定:常用的固定液為乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等,也可用兩種或兩種以上成分組成混合固定液。
5血液細(xì)胞組織化學(xué)顯示方法
純化學(xué)方法
金屬沉淀法
偶氮偶聯(lián)法
聯(lián)苯胺色素法
Schiff反應(yīng)
普魯士藍(lán)反應(yīng)類化學(xué)方法
物理學(xué)方法6血液細(xì)胞組織化學(xué)復(fù)染方法
復(fù)染是細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分顯色后,為了便于觀察而進(jìn)行的對(duì)比染色方法。
細(xì)胞核復(fù)染法:常用染料為蘇木精、甲基綠、核固紅、沙黃等。
細(xì)胞漿復(fù)染法:常用染料為伊紅、光綠等7血液細(xì)胞組織化學(xué)過(guò)氧化物酶染色(Peroxidasestain,POX)8血液細(xì)胞組織化學(xué)目的急性白血病的鑒別診斷AML:陽(yáng)性ALL:陰性9血液細(xì)胞組織化學(xué)分布特點(diǎn)-1原粒細(xì)胞:陰性,白血病副原粒細(xì)胞可呈陽(yáng)性反應(yīng)。中性粒細(xì)胞:自早幼粒細(xì)胞起隨細(xì)胞成熟陽(yáng)性強(qiáng)度遞增。陽(yáng)性顆粒圓形,規(guī)則,直徑與嗜蘇丹黑顆粒相仿,比瑞氏染色特殊顆粒大。嗜酸粒細(xì)胞:陽(yáng)性反應(yīng),顆粒比中性粒細(xì)胞的大,著色深。嗜堿粒細(xì)胞:陰性反應(yīng),在CML時(shí)可出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。10血液細(xì)胞組織化學(xué)分布特點(diǎn)-2在粒細(xì)胞系統(tǒng)中,過(guò)氧化物酶顆粒的出現(xiàn)和增多與特殊顆粒的出現(xiàn)和增多有平行關(guān)系。單核細(xì)胞系:原單呈陰性反應(yīng),幼單和單核細(xì)胞呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性顆粒少而細(xì)小,彌散分布,有的也可呈陰性反應(yīng)。其他細(xì)胞:淋巴細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、幼紅細(xì)胞、漿細(xì)胞和組織細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。有的吞噬細(xì)胞可呈陽(yáng)性反應(yīng)11血液細(xì)胞組織化學(xué)12血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑配制0.3%聯(lián)苯胺酒精溶液:
聯(lián)苯胺0.3g+95%乙醇全溶后,加入亞硝基鐵氰化鈉飽和水溶液1ml??杀4?-2年。
過(guò)氧化氫溶液配制:
3%過(guò)氧化氫1滴+蒸餾水5ml,須每次用時(shí)新鮮配制。
13血液細(xì)胞組織化學(xué)染色步驟于新鮮涂片上滴加復(fù)方聯(lián)苯胺染液3-8滴,使涂片蓋滿。1-2分鐘后加入等量過(guò)氧化氫溶液。4-8分鐘后用水沖洗,空氣中晾干。用瑞氏染液復(fù)染,涼干后油鏡觀察。14血液細(xì)胞組織化學(xué)染色原理
粒細(xì)胞及部分單核細(xì)胞胞漿內(nèi)的顆粒中含有過(guò)氧化物酶,該酶能分解過(guò)氧化氫,釋放出新生態(tài)的氧。從而使無(wú)色的聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)。聯(lián)苯胺藍(lán)是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物,它可進(jìn)一步氧化變成棕色的化合物
15血液細(xì)胞組織化學(xué)結(jié)果判斷陽(yáng)性反應(yīng)為藍(lán)色或藍(lán)棕色顆粒,定位于胞漿中。16血液細(xì)胞組織化學(xué)臨床意義ALL時(shí),原始細(xì)胞的POX陽(yáng)性小于3%。AML時(shí),原始細(xì)胞的陽(yáng)性≥3%。在多數(shù)的M1、絕大部分M2和M3中,原始細(xì)胞的陽(yáng)性率大于85%。M4和M5時(shí),原單有時(shí)可呈弱陽(yáng)性,但絕大多數(shù)的原單是POX陰性。M6,原粒和幼稚粒細(xì)胞是POX陽(yáng)性,幼紅細(xì)胞是POX陰性。在M7,血小板POX的活性只能在超微結(jié)構(gòu)上證實(shí)。MDS時(shí),粒細(xì)胞白血病和感染所致的WBC增高時(shí),成熟中性粒細(xì)胞的POX活性可能降低或消失。CML時(shí),成熟中性粒細(xì)胞的POX活性增強(qiáng)。17血液細(xì)胞組織化學(xué)注意事項(xiàng)
已固定的血膜因?yàn)槊敢哑茐牟荒茉僮鬟^(guò)氧化物酶染色。所用過(guò)氧化氫必須新鮮,加于血膜上應(yīng)能發(fā)生泡沫。過(guò)量時(shí)紅細(xì)胞可出現(xiàn)假陽(yáng)性。過(guò)氧化氫的濃度要適當(dāng)加減,過(guò)量則顆粒色深,不足則顆粒色淡。滴加過(guò)氧化氫液之后,最好將染片置于載物臺(tái)上,用低倍鏡觀察,發(fā)現(xiàn)胞漿出現(xiàn)陽(yáng)性顆粒時(shí),立即水洗。18血液細(xì)胞組織化學(xué)19血液細(xì)胞組織化學(xué)
糖原染色
(Periodicacid-Schiffreaction,PAS)20血液細(xì)胞組織化學(xué)目的
紅白血?。?+++)與巨幼紅細(xì)胞貧血(-)的鑒別診斷MDS與巨幼紅細(xì)胞貧血(-)的鑒別診斷單核細(xì)胞白血病(+)與組織細(xì)胞?。∕H)的鑒別診斷淋巴肉瘤、何杰金病與急性淋巴細(xì)胞白血病的鑒別診斷高歇病與尼曼-匹克病的鑒別診斷
以上都是前者增高,后者降低或陰性。
21血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑-110g/L過(guò)碘酸液Schiff染液:堿性品紅0.5gDH2O100mlDH2O煮沸后待片刻,加入堿性品紅,振蕩數(shù)分鐘使品紅溶解,冷至50℃加入1M的鹽酸20ml,混勻。待冷卻至25℃加入偏重亞硫酸鈉0.5g,混合,置于帶塞的棕色瓶中,放于暗處24小時(shí)。染液為無(wú)色,如為微紅則加活性炭1-2g,混合過(guò)濾,如過(guò)濾液仍有紅色,應(yīng)再加少許活性炭,至紅色完全被吸收為止。制成后置于棕色瓶?jī)?nèi)保存在冰箱備用,如變?yōu)榧t色,則不能使用。
22血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑-2
蘇木素液:蘇木素0.9g95%乙醇10ml銨(鉀)明礬20gDH2O200ml將蘇木素溶于95%的乙醇,鉀明礬溶于水(可加熱),然后將蘇木素液加入明礬液中混合,用強(qiáng)火煮沸后加氧化汞0.5g,迅速攪拌,呈深紫色,迅速移入冷水中,次日過(guò)濾,臨用時(shí)取此液95ml加冰醋酸5ml,可使細(xì)胞著色清楚。
23血液細(xì)胞組織化學(xué)染色步驟
將新鮮血片或骨髓片用95%乙醇固定10分鐘。10g/L過(guò)碘酸液作用20分鐘DH2O洗滌1分鐘,晾干Schiff染液,60分鐘用自來(lái)水洗滌15分鐘(細(xì)水長(zhǎng)流沖洗)蘇木素染液10分鐘。自來(lái)水沖洗15分鐘,待干鏡檢。
24血液細(xì)胞組織化學(xué)染色原理
過(guò)碘酸能使細(xì)胞內(nèi)的多糖乙二醇基氧化成二醛,再與Schiff氏液的無(wú)色品紅結(jié)合,呈紅色,定位于胞漿上。
25血液細(xì)胞組織化學(xué)結(jié)果判斷
正常BM:有核紅細(xì)胞幾乎均呈陰性反應(yīng),在AML-M6,幼紅細(xì)胞為PAS強(qiáng)陽(yáng)性。中性粒細(xì)胞:原粒細(xì)胞多為陰性,早幼粒階段開(kāi)始呈PAS陽(yáng)性,其后各階段陽(yáng)性逐漸增強(qiáng)。巨核細(xì)胞和血小板:不含糖原,但含粘多糖等,故巨核細(xì)胞為細(xì)小彌散的陽(yáng)性,PLT為粉紅色。ALL:可以是密集粗塊狀的顆粒,也能是細(xì)小彌散的顆粒,或是這兩種顆粒的混合。ALL的PAS也可能為陰性,特別是L3時(shí)。單核細(xì)胞白血病,原單細(xì)胞常為陰性,幼單和成熟單可有弱陽(yáng)性或彌散陽(yáng)性。
26血液細(xì)胞組織化學(xué)注意事項(xiàng)
1)
Schiff液變紅不能再用。2)
堿性品紅的質(zhì)量很重要,如堿性品紅不合格,加活性炭,顏色也不被吸附。如無(wú)蘇木精復(fù)染液,可用1%甲綠復(fù)染25分替代。
27血液細(xì)胞組織化學(xué)28血液細(xì)胞組織化學(xué)29血液細(xì)胞組織化學(xué)30血液細(xì)胞組織化學(xué)非特異性酯酶染色31血液細(xì)胞組織化學(xué)原理
非特異性酯酶是作用于短鏈脂肪的酶,當(dāng)酯酶活性存在時(shí),水解基質(zhì)中的α-醋酸萘酚,與重氮鹽偶聯(lián),生成不溶性的有機(jī)產(chǎn)物,定位于胞漿上。32血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑甲醛:基質(zhì)液:1/15M的磷酸緩沖液PH7.440ml10g/Lα-醋酸萘酚50%丙酮液0.8ml重氮鹽(DiazoblueB)40mg33血液細(xì)胞組織化學(xué)方法
新鮮涂片用甲醛蒸汽固定5分鐘。流水沖洗5分鐘,晾干。置于基質(zhì)液中37℃1小時(shí),水洗泡10分鐘。20g/L甲綠復(fù)染20-30分鐘。水洗,晾干,鏡檢。34血液細(xì)胞組織化學(xué)臨床意義
單核細(xì)胞系統(tǒng)呈陽(yáng)性,伴隨著細(xì)胞的成熟而加強(qiáng),對(duì)AL有鑒別診斷作用。35血液細(xì)胞組織化學(xué)非特異性酯酶-氟化鈉抑制試驗(yàn)同非特異性酯酶,只是在1ml作用液中,加入1.5mg氟化鈉,即可抑制單核細(xì)胞的酯酶,故可作急性單核細(xì)胞白血病的鑒別診斷。
36血液細(xì)胞組織化學(xué)37血液細(xì)胞組織化學(xué)38血液細(xì)胞組織化學(xué)39血液細(xì)胞組織化學(xué)急性白血病中的組化染色
白血病POXNSEPASALL
—+
+AML
M0+——
M1+(>3原始細(xì)胞)——
M2++——
M3++++—
M4++(原單細(xì)胞)—
M5—/+++—/+
M6+(原粒細(xì)胞)—+(幼紅細(xì)胞)
M7—++40血液細(xì)胞組織化學(xué)
中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色(AKP)
41血液細(xì)胞組織化學(xué)目的鑒別白血?。ǖ停┖桶籽樱ǜ撸┓磻?yīng)鑒別淋巴肉瘤(高)和何杰金病鑒別細(xì)菌性感染(高)與病毒性感染
42血液細(xì)胞組織化學(xué)分布
血細(xì)胞的堿性磷酸酶活性,主要見(jiàn)于成熟的中性粒細(xì)胞,定位于胞漿中。
43血液細(xì)胞組織化學(xué)原理
細(xì)胞中的AKP在PH9.5-9.6緩沖液中能使基質(zhì)中的磷酸萘酚鈉水解,釋放出萘酚。后者與一種穩(wěn)定的重氮鹽(常用有固紫Fast--Garnet,GBC或固藍(lán)RR)偶聯(lián),生成不溶性的偶氮染料,沉積于細(xì)胞上。
44血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑
95%乙醇固醬紫GBCAS-BI磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml0.2Mtris緩沖液:三羥甲基氨基甲烷2.43g+DH2O溶至100ml。0.05Mtris緩沖液(PH8.6-9.0):0.2Mtris緩沖液25ml+0.1MHCL49ml貯存液:50mlAS-BI磷酸萘酚+PH8.80.05Mtris緩沖液50ml混勻,冰箱保存1%甲基綠
45血液細(xì)胞組織化學(xué)染色步驟
新鮮BM片及血片待干95%乙醇固定10分鐘固醬紫1mg+2ml貯存液混勻,立即滴加數(shù)滴在血片或BM片上,置37℃孵箱孵育30分鐘用蒸餾水快沖
放入1%甲綠中復(fù)染5分鐘用蒸餾水快沖,待干,鏡檢
46血液細(xì)胞組織化學(xué)結(jié)果判斷
陽(yáng)性顆粒呈紅色,定位于成熟中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)。
計(jì)數(shù)方法,按堿酶活性強(qiáng)弱,分為0-4+共5級(jí)。分?jǐn)?shù)特點(diǎn)0胞漿內(nèi)無(wú)紅色的顆粒1彌散的紅色,偶見(jiàn)顆粒2彌散的紅色,有中等量的顆粒3顯著的紅色,有較多的顆粒4顯著的紅色,有充滿胞漿的粗大顆粒47血液細(xì)胞組織化學(xué)計(jì)算積分分?jǐn)?shù)細(xì)胞數(shù)目積分0200145452255035154520總數(shù)100130=LAP積分
48血液細(xì)胞組織化學(xué)50血液細(xì)胞組織化學(xué)鐵粒染色51血液細(xì)胞組織化學(xué)原理
骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細(xì)胞外鐵,其中的三價(jià)鐵與分子中的蛋白質(zhì)結(jié)合不牢,經(jīng)稀鹽酸處理后而游離出來(lái),并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍(lán)反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應(yīng)的強(qiáng)弱了解骨髓中鐵的含量。
52血液細(xì)胞組織化學(xué)試劑
酸性亞鐵氰化鉀溶液:200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份取200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中,緩緩加入濃鹽酸,邊滴加邊搖勻,至出現(xiàn)白色沉淀,再滴加200g/L亞鐵氰化鉀,邊滴加邊搖勻,至白色沉淀消失為止,備用。2g/L核固紅-硫酸鋁溶液:取硫酸鋁10g加入100mlDH2O再加入核固紅EMER出品0.2g,置于37℃水浴中1小時(shí),并經(jīng)常振蕩,使溶解,過(guò)濾后使用。53血液細(xì)胞組織化學(xué)方法選骨髓小粒豐富的骨髓涂片玻片上滴加酸性亞鐵氰化鉀,染色30分鐘。(可置于37℃)用DH2O沖洗后用核固紅染液復(fù)染10-15分鐘。流水沖洗,晾干,油鏡檢查。54血液細(xì)胞組織化學(xué)結(jié)果
正常人細(xì)胞外鐵:+-++幼紅細(xì)胞呈鮮紅色,胞漿成淡黃紅色,鐵粒呈藍(lán)綠色。細(xì)胞外鐵的判斷用低倍鏡觀察涂片,特別時(shí)涂片尾部和骨髓小粒附近。5
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