生物質(zhì)譜技術(shù)和方法培訓(xùn)課件

生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)譜分析法（massspectrometry，MS）是將化合物形成離子和碎片離子，按質(zhì)荷比（m/z）的不同進(jìn)行分離，來(lái)進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。所得結(jié)果用質(zhì)譜圖（亦稱質(zhì)譜，MassSpectrum）表示。根據(jù)質(zhì)譜圖提供的信息可以進(jìn)行有機(jī)物及無(wú)機(jī)物的定性和定量分析、生物大分子的結(jié)構(gòu)分析、樣品中各種同位素比的測(cè)定及固體表面的結(jié)構(gòu)和組成分析等。2生物質(zhì)譜技術(shù)和方法生物質(zhì)譜（Bio-massspectrometry，Bio-MS）是用于生物分子分析的質(zhì)譜技術(shù)。生物質(zhì)譜要求測(cè)定上萬(wàn)甚至是幾十萬(wàn)的相對(duì)分子質(zhì)量。隨著電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)的完善和成熟，生物大分子的質(zhì)譜分析才得以實(shí)現(xiàn)。3生物質(zhì)譜技術(shù)和方法

TheNobelPrizeinChemistry2002"forthedevelopmentofmethodsforidentificationandstructureanalysesofbiologicalmacromolecules""fortheirdevelopmentofsoftdesorptionionisationmethodsformassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules""forhisdevelopmentofnuclearmagneticresonancespectroscopyfordeterminingthethree-dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution"約翰·芬田中耕一庫(kù)爾特·伍斯里奇4生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)譜法的基本原理質(zhì)譜分析的基本過(guò)程是使樣品在離子源中發(fā)生電離，生成不同質(zhì)荷比的帶電離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器，在其中再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使其發(fā)生色散、聚焦，獲得質(zhì)譜圖。5生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)譜分析中，多種離子化技術(shù)均可使物質(zhì)分子失去外層價(jià)電子形成分子離子（molecularion，M+），分子離子中的化學(xué)鍵還可以繼續(xù)發(fā)生某些有規(guī)律的斷裂而形成不同質(zhì)量的碎片離子（fragmention）：M→→→M+

+碎片離子+中性分子6生物質(zhì)譜技術(shù)和方法被分析樣品離子電離后經(jīng)加速進(jìn)入磁場(chǎng)時(shí)，其動(dòng)能與加速電壓及電荷z有關(guān)，即：zeU=1/2·mv2其中：z為電荷數(shù)，e為元電荷（e=1．60×10-19C），U為加速電壓，m為離子的質(zhì)量，v為離子初加速后的運(yùn)動(dòng)速度。具有速度v的帶電粒子進(jìn)入質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終各種離子按質(zhì)荷比（m／z）的不同實(shí)現(xiàn)分離。7生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀包括進(jìn)樣系統(tǒng)、電離系統(tǒng)、質(zhì)量分析器和檢測(cè)系統(tǒng)。為了獲得離子的良好分析，必須避免離子損失，因此凡有樣品分子及離子存在和通過(guò)的地方，必須處于真空狀態(tài)。在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，一般過(guò)程是：通過(guò)合適的進(jìn)樣裝置將樣品引入并進(jìn)行氣化。氣化后的樣品引入到離子源進(jìn)行電離。電離后的離子經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)募铀俸筮M(jìn)入質(zhì)量分析器，按不同的m／z進(jìn)行分離。然后到達(dá)檢測(cè)器，產(chǎn)生不同的信號(hào)而進(jìn)行分析。8生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)量分析器檢測(cè)器樣品導(dǎo)入系統(tǒng)離子源真空泵m/z計(jì)算機(jī)控制與數(shù)據(jù)處理相對(duì)豐度質(zhì)譜儀的構(gòu)成9生物質(zhì)譜技術(shù)和方法Data

System

Massspectrum out

InletSystem

MassAnalyzer

IonSourceDetectorSample inInletsystems:Ionsources:Massanalyzers:

?Simplevacuumlock

?HPLC

?GC?Electrospray(ESI)?MALDI?FAB/LSIMS?Electronionization(EI)?Quadrupole?Time-of-flight?Iontrap?Magneticsector?FTMSMassSpectrometerSchematic

Vacuumenvelope10生物質(zhì)譜技術(shù)和方法離子源(ionsource)質(zhì)譜儀中將分子轉(zhuǎn)化為離子的裝置稱為離子源(ionsource)。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對(duì)于不同的分子應(yīng)選擇不同的離解方法。通常將能給樣品較大能量、生成較多碎片離子的電離方法稱為硬電離方法（如電子轟擊離子化，EI），而給樣品較小能量、碎片離子較少或不生成碎片離子的電離方法稱為軟電離方法。11生物質(zhì)譜技術(shù)和方法生物質(zhì)譜中有代表性的離子源1．電噴霧電離(ElectrosprayIonization，ESI)2．離子噴霧電離（IonsprayIonization，ISI）3．大氣壓化學(xué)電離(AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI)4．基質(zhì)輔助激光解吸電離(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization，MALDI)5．快原子轟擊電離(FastAtomBonbardmentIonization，F(xiàn)AB)12生物質(zhì)譜技術(shù)和方法離子源是質(zhì)譜儀的心臟，可以將離子源看作是離子化反應(yīng)器，樣品在其中發(fā)生一系列的特征裂解反應(yīng)，反應(yīng)在很短時(shí)間（10-11s）內(nèi)發(fā)生，所以可以快速地獲得質(zhì)譜圖。13生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心，它將離子源產(chǎn)生的離子按其質(zhì)量和電荷比（質(zhì)荷比m/z，m—離子的質(zhì)量數(shù)，z—離子攜帶的電荷數(shù)）的不同﹑在空間的位置﹑時(shí)間的先后或軌道的穩(wěn)定與否進(jìn)行分離,以便得到按質(zhì)荷比（m/z）大小順序排列而成的質(zhì)譜圖。14生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)量分析器(massanalyzer)的種類1.磁質(zhì)量分析器(單聚焦質(zhì)量分析器,雙聚焦質(zhì)量分析器)2.四極質(zhì)量分析器(四極桿濾質(zhì)器)3.飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)4.離子阱(IonTrap)質(zhì)量分析器5.離子回旋共振質(zhì)量分析器其中,2﹑3﹑4是目前生物質(zhì)譜分析中常用的質(zhì)量分析器15生物質(zhì)譜技術(shù)和方法檢測(cè)器1.直接電檢測(cè)器2.電子倍增器3.閃爍檢測(cè)器4.微通道板16生物質(zhì)譜技術(shù)和方法計(jì)算機(jī)控制與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.監(jiān)控各單元的工作狀態(tài),實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜儀的全自動(dòng)操作.2.數(shù)據(jù)的采集和簡(jiǎn)化.3.質(zhì)量數(shù)的轉(zhuǎn)換.4.扣除本底或相鄰組分的干擾.5.譜峰強(qiáng)度歸一化.6.標(biāo)出高分辨質(zhì)譜的元素組成.17生物質(zhì)譜技術(shù)和方法7.用總離子流對(duì)質(zhì)譜峰強(qiáng)度進(jìn)行修正.8.譜圖的累加﹑平均.9.輸出質(zhì)量色譜圖.10.單離子檢測(cè)和多離子檢測(cè).11.譜圖檢索.18生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)譜圖質(zhì)譜分析中，按各離子m/z的順序及相對(duì)強(qiáng)度大小記錄分析結(jié)果的圖譜即為質(zhì)譜圖。由于圖譜中離子的質(zhì)量及相對(duì)強(qiáng)度是各物質(zhì)所特有的，即反映了物質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此通過(guò)質(zhì)譜解析可以進(jìn)行物質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)分析。常見(jiàn)的質(zhì)譜圖是經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理后得到的棒圖（bargraph）。19生物質(zhì)譜技術(shù)和方法常見(jiàn)的質(zhì)譜圖是經(jīng)計(jì)算機(jī)處理的棒圖.圖中,縱坐標(biāo)表示離子的相對(duì)豐度(以質(zhì)譜中最強(qiáng)峰的高度為100%,并將此峰稱位基峰,其余峰按與基峰的比例加以表示,又稱為相對(duì)強(qiáng)度);橫坐標(biāo)表示離子的質(zhì)荷比.根據(jù)峰位(棒位)可進(jìn)行定性鑒別;根據(jù)相對(duì)豐度可進(jìn)行定量測(cè)定.15282931(基峰)32(分子離子峰)33100806040201020304050m/z相對(duì)峰強(qiáng)棒圖(bargraph)CH3OH20生物質(zhì)譜技術(shù)和方法21生物質(zhì)譜技術(shù)和方法%Intensity1239.41679.82120.22560.6Mass(m/z)

03001.00799.01020301001480.60

1567.46908070605040804.682044.211738.351570.451439.651894.262047.21927.77843.872470.782210.101923.271724.381000.701209.841391.671574.122661.872807.672066.13牛血清蛋白（BSP）酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖

VoyagerSpec#1[BP=1480.6,8127]22生物質(zhì)譜技術(shù)和方法10 030%Int.100 90 80 70 60 50 403494349534963497349834993500350135023503

3497.64223496.6541 3498.62563495.65453499.652820

3500.65953501.6502Resolution>20,000m/z胰島素的高分辨質(zhì)譜圖23生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)譜儀的主要性能指標(biāo)衡量質(zhì)譜儀整體性能的主要指標(biāo)有：質(zhì)量范圍分辨率質(zhì)量準(zhǔn)確度靈敏度掃描速度等24生物質(zhì)譜技術(shù)和方法

質(zhì)量分析器質(zhì)量上限 (m/z)質(zhì)量準(zhǔn)確 度（u）分辨率 （R）掃描速度 （u/s）適用范圍四極桿質(zhì) 譜＜40000.1500～ 30004000～6000小分子、多電荷離子大分子離子阱質(zhì) 譜＜100000.11000～ 100004000～6000小分子、多電荷離子大分子飛行時(shí)間 質(zhì)譜＞500000

0.001(高 分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜)500～1000（低），2000～20000（高）＞1000000小分子、大分子不同類型質(zhì)量分析器的性能指標(biāo)25生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)量范圍(massrange)是指質(zhì)譜儀能夠測(cè)量的離子質(zhì)量范圍，通常用最小和最大離子的離子質(zhì)量表示。質(zhì)譜分析中，是以核素12C質(zhì)量（12C=12.000u）的1/12為一個(gè)質(zhì)量單位（u）。1u=（12.00000g·mol-1/6.02214×1023mol-1）/12=1.66054×10-24g在生物大分子的質(zhì)譜分析中，還常用道爾頓（dalton，Da）作為度量單位。1Da=1.6603×10-24g。Da與u兩者相差萬(wàn)分之三左右，在生物質(zhì)譜分析中，可以視為1Da=1u。26生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)量準(zhǔn)確度（massaccuracy）質(zhì)量準(zhǔn)確度又稱質(zhì)量精度，即離子質(zhì)量實(shí)測(cè)值M與理論值M0的相對(duì)誤差：質(zhì)量精度=∣M－M0∣/m×106(ppm)（m為離子質(zhì)量數(shù)的整數(shù)）儀器的質(zhì)量精度一般應(yīng)小于10ppm。27生物質(zhì)譜技術(shù)和方法分辨率(resolution，R)分辨率是指儀器能分離相鄰兩質(zhì)譜峰的能力。若將強(qiáng)度近似相等、質(zhì)量分別為M和M+M的兩個(gè)相鄰峰恰好分開(kāi)，則質(zhì)譜儀的分辨率定義為：R＝m1/(m2-m1)＝m1/△M其中m1、m2：為質(zhì)量數(shù)，且m1<m2：，故在兩峰質(zhì)量相差越小時(shí)，要求儀器分辨率越大。28生物質(zhì)譜技術(shù)和方法重點(diǎn)介紹兩種生物質(zhì)譜分析方法基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜（MatrixAssistedLaserDesorptionIonization/TimeofFlightMassSpectra，MALDI-TOFMS）電噴霧電離(ElectrosprayIonization，ESI)質(zhì)譜29生物質(zhì)譜技術(shù)和方法電噴霧離子化（ESI）原理內(nèi)襯彈性石英管的不銹鋼毛細(xì)管（內(nèi)徑0.1～0.15mm）被加以2～5kV的正電壓，與相距約1～2cm接地的反電極形成強(qiáng)靜電場(chǎng)。被分析的樣品溶液從毛細(xì)管流出時(shí)，在電場(chǎng)作用下形成高度荷電的霧狀小液滴；在向質(zhì)量分析器移動(dòng)的過(guò)程中，液滴因溶劑的揮發(fā)逐漸縮小，其表面上的電荷不斷增大。當(dāng)電荷之間的排斥異力足以克服表面張力時(shí)（瑞利極限），液滴發(fā)生裂分；經(jīng)過(guò)這樣反復(fù)的溶劑揮發(fā)-液滴裂分過(guò)程，最后產(chǎn)生單個(gè)的氣態(tài)離子。由于沒(méi)有外界能量直接作用于分子，因此對(duì)分子結(jié)構(gòu)破壞較少，是一種典型的“軟電離”方式。30生物質(zhì)譜技術(shù)和方法質(zhì)量分析器(massanalyzer)在生物質(zhì)譜中，與ESI離子化源配合使用的質(zhì)量分析器主要有：、四極濾質(zhì)器、離子阱分析器和離子回旋共振分析器等。隨著技術(shù)的發(fā)展，也可以采用這些分析器的變型。32生物質(zhì)譜技術(shù)和方法四極濾質(zhì)器（QuadrupoleMassFilter）四極濾質(zhì)器也稱四極質(zhì)量分析器，它由四根截面呈雙曲面的平行金屬桿電極組成，離子束穿過(guò)對(duì)準(zhǔn)四根桿之間空間的準(zhǔn)直小孔。相對(duì)的一對(duì)電極是等電位的，兩對(duì)電極之間的電位是相反的。離子源的電位比四極濾質(zhì)器的電位略高幾個(gè)伏特，以提供離子沿傳播中心軸飛行所需的動(dòng)能。33生物質(zhì)譜技術(shù)和方法離子阱(iontrap)質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器亦稱四極離子阱（quadropoleiontrp）或Paul阱，簡(jiǎn)稱離子阱，是一種通過(guò)電場(chǎng)或磁場(chǎng)將氣相離子控制并貯存一段時(shí)間的裝置。這種分析器是由雙曲線表面的中心環(huán)形電極（ringelectrode）和上下各一個(gè)端蓋電極（endcapelectrode）組成，中間形成一個(gè)空腔（阱），因此而成為離子阱。端蓋電極接地，環(huán)形電極施以射頻電壓。離子阱內(nèi)充有一定量的氦氣（約10-3（Torr），這有利于離子朝中心聚集，而離子聚集得越緊湊，離子能量和位置分散越小，有利于提高分辨率和靈敏度。34生物質(zhì)譜技術(shù)和方法液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquidchromatography/massspectrometry，LC-MS）LC-MS把液相色譜技術(shù)強(qiáng)有力的分離能力與質(zhì)譜技術(shù)有效的定性分析能力相結(jié)合，特別適合于復(fù)雜體系的分離分析，目前已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最重要的技術(shù)平臺(tái)之一。LC-MS的開(kāi)發(fā)在技術(shù)上十分困難，直到電噴霧電離（ESI）接口和大氣壓化學(xué)電離（APCI）接口出現(xiàn)，在20世紀(jì)90年代才有了成熟的商品化的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。35生物質(zhì)譜技術(shù)和方法

HPLC*含有緩沖劑的 水相/有機(jī)溶劑*非揮發(fā)性分析樣品

Interface*脫溶劑*使分析樣品 發(fā)生離子化

MS*高真空度*按m/z分析 產(chǎn)生的離子LC-MS的基本構(gòu)成☆接口的作用就是將HPLC與MS兩者實(shí)現(xiàn)在線的對(duì)接?！钏闹饕饔檬敲撊?lái)自HPLC的大量溶劑，使分析樣品由 液相轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嗖l(fā)生離子化?！罱涌谛阅艿暮脡脑诤艽蟪潭壬蠜Q定著色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器性能 的優(yōu)劣。36生物質(zhì)譜技術(shù)和方法好的HPLC條件可能是“壞的”MS條件，二者難以匹配要實(shí)現(xiàn)HPLC與MS的有效的聯(lián)用，必須解決以下困難問(wèn)題：色譜儀與質(zhì)譜儀的壓力匹配問(wèn)題色譜儀與質(zhì)譜儀的流量匹配問(wèn)題氣化問(wèn)題37生物質(zhì)譜技術(shù)和方法譜圖類型色譜-質(zhì)譜提供的信息MS的譜圖有:1.質(zhì)譜圖2.色譜圖3.全掃描色譜-質(zhì)譜三維譜38生物質(zhì)譜技術(shù)和方法譜圖類型色譜-質(zhì)譜提供的信息MS的譜圖有:1.質(zhì)譜圖

質(zhì)譜圖是一次掃描時(shí)間內(nèi)得到的峰強(qiáng)質(zhì)荷比圖。掃描方式又有連續(xù)掃描和跳變掃描之分。2.色譜圖3.全掃描色譜-質(zhì)譜三維譜39生物質(zhì)譜技術(shù)和方法色譜圖通常有三種類型:1.總離子流色譜圖(TIC)2.質(zhì)量色譜圖(MC)3.選擇離子監(jiān)測(cè)圖(SIM)40生物質(zhì)譜技術(shù)和方法一個(gè)例子:

反相高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法測(cè)定 人血漿、尿樣中D,L-異亮氨酸和D,L-別異 亮氨酸異構(gòu)體H2NCOOHCHCH2CHH3CCH3H2NCOOHCHCHH2CCH3CH3LeucineIsoleucine41生物質(zhì)譜技術(shù)和方法圖.17對(duì)氨基酸和甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物的RP-HPLC熒光檢測(cè)色譜圖Fig.ChromatogramsofOPTA-AcCys-derivativesof17pairsofstandardaminoacidsandGly.A:L-Ile,B:L-allo-Ile,C:D-Ile,D:D-allo-IleConditions:mobilephaseA,50mmol/LNH4AC;mobilephaseB:methanol;0-10min,mobilephaseB10%;10-30min,mobilephaseB10-40%(lineargradient);30-70min,mobilephaseB40%;flowrate:0.2ml/min;colu