免疫學(xué)技術(shù)-免疫細(xì)胞及其功能檢驗(yàn)技術(shù)（臨床免疫檢驗(yàn)課件）

淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測前言外周血白細(xì)胞主要包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。正常情況下機(jī)體各類淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能保持相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)人體感染病原微生物或發(fā)生免疫性疾病時(shí)，均可引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能變化。臨床上常根據(jù)不同淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志即分化群（CD）進(jìn)行淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)量檢測。淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。通過對(duì)機(jī)體淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能測定，可為疾病的診斷、治療、療效評(píng)估等提供重要依據(jù)淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能變化數(shù)量檢測功能測定根據(jù)淋巴細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志體內(nèi)試驗(yàn)體外試驗(yàn)間接熒光免疫法T細(xì)胞數(shù)量檢測針對(duì)T細(xì)胞數(shù)量的檢測主要依據(jù)T細(xì)胞及其亞群細(xì)胞表面標(biāo)志如CD3、CD4及CD8等分子間接熒光免疫法免疫組織化學(xué)法流式細(xì)胞術(shù)酶標(biāo)法（ABC法、APAAP法）金標(biāo)法（即IGSS法）T細(xì)胞功能檢測淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測T細(xì)胞增殖試驗(yàn)CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)抗原特異性T細(xì)胞定量檢測體內(nèi)試驗(yàn)形態(tài)學(xué)法3H-TdR摻入法MTT比色法51Cr釋放法MHC-抗原肽四聚體技術(shù)結(jié)核菌素試驗(yàn)PHA皮膚試驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)——形態(tài)學(xué)法PBMCPHA5％CO2

37℃培養(yǎng)72h細(xì)胞涂片染色顯微鏡檢查未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)轉(zhuǎn)化率（％）＝轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的淋巴細(xì)胞總數(shù)100％×T細(xì)胞增殖試驗(yàn)——3H-TdR摻入法SI＝試驗(yàn)孔cpm均值對(duì)照孔cpm均值外周血T細(xì)胞PHA發(fā)生增殖MTT含藍(lán)色甲臜顆粒的T細(xì)胞有機(jī)溶劑測吸光度（A）值計(jì)算SI判定細(xì)胞增殖結(jié)果T細(xì)胞增殖試驗(yàn)——MTT法SI＝試驗(yàn)孔A均值對(duì)照孔A均值(SI≧2具有意義)淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測定γ射線CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)——51Cr釋放法51Cr特異性釋放率＝試驗(yàn)孔cmp均值最大釋放孔cmp均值-自發(fā)釋放孔cmp均值-自發(fā)釋放孔cmp均值100％×根據(jù)T細(xì)胞活化的雙識(shí)別原理，用生物工程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測抗原特異性T細(xì)胞抗原特異性T細(xì)胞定量檢測MHC-抗原肽四聚體技術(shù)用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀測定淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類確定Th1/Th2細(xì)胞百分率淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測Th1和Th2分泌的細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞因子Th1Th2IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++原理體內(nèi)試驗(yàn)12結(jié)核菌素試驗(yàn)PHA皮膚試驗(yàn)B細(xì)胞數(shù)量及功能檢測數(shù)量檢測1.mIg的檢測：免疫熒光、免疫組化2.CD分子的檢測：檢測CD19、CD20、CD21、CD22、CD5等3.IgGFc受體的檢測：EA花環(huán)試驗(yàn)4.小鼠紅細(xì)胞受體的檢測：花環(huán)試驗(yàn)功能檢測1.B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：3H-TdR摻入法、MTT2.B細(xì)胞抗體產(chǎn)生能力檢測：溶血空斑試驗(yàn)、ELISPOT經(jīng)典溶血空斑試驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)可在單細(xì)胞水平上檢測B產(chǎn)生抗體和T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子NK細(xì)胞數(shù)量及功能檢測NK細(xì)胞功能檢測方法根據(jù)NK細(xì)胞表面CD分子進(jìn)行檢測檢測CD3、CD56、CD16等，計(jì)數(shù)CD3-CD56+CD16+的細(xì)胞數(shù)即為NK細(xì)胞數(shù)形態(tài)學(xué)法常采用臺(tái)盼藍(lán)染色酶釋法LDH釋放法熒光法時(shí)間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法51Cr釋放法125I-UdR釋放法流式細(xì)胞術(shù)采用碘化丙啶（PI）染色法數(shù)量檢測010203B細(xì)胞數(shù)量及功能檢測NK細(xì)胞數(shù)量及功能檢測

小結(jié)T細(xì)胞數(shù)量及功能檢測思考題C細(xì)胞免疫是機(jī)體重要的免疫反應(yīng)之一，但細(xì)胞免疫反應(yīng)過程比較復(fù)雜，參與反應(yīng)的成分眾多，影響因素也多種多樣，因此，準(zhǔn)確檢測機(jī)體細(xì)胞免疫水平及其變化具有一定的難度。1.試問目前臨床開展的細(xì)胞免疫檢測項(xiàng)目有哪些？如何用于評(píng)估機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)？2.試討論細(xì)胞免疫檢測新技術(shù)的研究現(xiàn)狀及其發(fā)展方向。免疫細(xì)胞的分離與純化免疫細(xì)胞在人體中擔(dān)任著十分重要的角色，各種免疫細(xì)胞是完成免疫應(yīng)答及其調(diào)控的基礎(chǔ)。因此，將免疫細(xì)胞從混合細(xì)胞群體中分離出來對(duì)于了解其在免疫應(yīng)答中的作用及相互關(guān)系有著重要意義前言免疫細(xì)胞的分離純化指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等通過分離、純化免疫細(xì)胞及其亞群并對(duì)其數(shù)量和功能測定，可以判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐和科學(xué)研究具有重要意義免疫細(xì)胞白細(xì)胞分離

自然情況下紅細(xì)胞的沉降速度快于白細(xì)胞從而達(dá)到分離白細(xì)胞的目的

某些高分子聚合物（如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮等）可使紅細(xì)胞凝集呈串錢狀，加速紅細(xì)胞沉降使之更易與白細(xì)胞分離自然沉降法高分子聚合物沉降法外周血單個(gè)核細(xì)胞分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：主要是指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞常用分離液：Ficoll液和Percoll液分離人外周血中各類血細(xì)胞密度表細(xì)胞種類相對(duì)密度紅細(xì)胞1.093白細(xì)胞1.092血小板1.030~1.035淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.075~1.090Ficoll分離法注意溫度以20℃最適宜，超過25℃影響細(xì)胞得率Percoll分離法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min淋巴細(xì)胞的純化1.黏附法用于去除單核細(xì)胞2.羧基鐵吞噬法磁鐵吸引羧基鐵原理3.苯丙氨酸甲酯去除法苯丙氨酸甲酯具有親溶酶體性質(zhì)1.多次洗滌離心法2-3次離心、洗滌去除大部分血小板2.胎牛血清梯度離心法適用于外周血中血小板異常增多的情況1.低滲裂解法不同細(xì)胞對(duì)滲透壓的滲透脆性不同2.氯化銨裂解法在PBMC懸液中加入適量0.83%氯化銨去除血小板去除單核細(xì)胞去除紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細(xì)胞并低滲裂解E花環(huán)沉降法：主要用于T細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞亞群的分離PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時(shí)獲得T細(xì)胞獲得B細(xì)胞預(yù)熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓尼龍棉分離法可分離T細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群的分離免疫磁珠分離法淋巴細(xì)胞亞群的分離流式細(xì)胞術(shù)分離法是目前比較先進(jìn)的細(xì)胞分離手段和方法吞噬細(xì)胞的分離單核細(xì)胞分離巨噬細(xì)胞分離中性粒細(xì)胞分離Percoll密度梯度分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法免疫磁珠分離法