干細胞技術(shù)模板課件

干細胞技術(shù)StemCells7/27/20231.個體發(fā)育歷史研究回顧作為多細胞的聚集物，人體不僅由數(shù)以億計的細胞構(gòu)成，而且更重要的是這些細胞分成了不同的細胞類型。實際上這些不同類型的細胞有些在外形上差異極大，功能也不同。7/27/2023人們早就知道構(gòu)成人體的所有細胞均來自于一個細胞——受精卵，但在歷史上對受精卵如何發(fā)育成個體，卻爭論了許久。其中一個重要的流派是先成論（或者稱預成論）者，他們主張在受精卵中其實已經(jīng)預先有了一個微型的胎兒，隨后的發(fā)育過程僅僅是一個簡單的生長過程，你也可以把它理解成一個放大的過程。7/27/2023而更加激進的預成論者斷言，在這個微型胎兒的更加微型的精子和卵子中應該還含有它們自己的微型胎兒，以此類推直到無窮。就像那個著名的俄羅斯套裝娃娃，一個套一個。7/27/2023預成論者的說法，在今天聽來實在是過于荒唐，不過這也不能就此論定他們就很愚蠢。無論如何不同物種的受精卵不管看起來多么相似，然而它們卻注定了要發(fā)育成不同的物種。很顯然在受精卵中一定得有些什么保證這一切的有序發(fā)生，預成論者犯的錯誤在于將這個問題簡單化和庸俗化了。7/27/2023伴隨著人們對細胞的認識逐步加深，人們逐步的確信細胞來自細胞，而細胞的繁殖也決不是一個簡單的放大。那么在個體的發(fā)育中，胚胎發(fā)育的遺傳控制形式究竟是什么？對此德國遺傳學家魏斯曼提出了一個解決胚胎發(fā)育的遺傳控制的非常有創(chuàng)見的方案，同時也是第一個真正完整的遺傳學說。7/27/2023魏斯曼對于初始的全能細胞，如何分化為個體中不同類別的細胞上，魏斯曼面臨兩種選擇，非常不幸的是限于當時的背景，魏斯曼放棄了他的第二種假說——激活學說，而選擇了第一種——分割學說。分割學說的意思簡單來說，就是在細胞分裂的時候，是進行的不等分裂，一個全能的細胞就此不斷的分化，最終形成特化的功能細胞。7/27/20232.什么是干細胞現(xiàn)在我們都知道，在細胞分裂的過程中，是進行的均等分裂，也就是說不僅兩個子代細胞是一樣的，而且它們和母本細胞也是一樣的。而分化的發(fā)生依賴的是激活一些相關(guān)的基因以及關(guān)閉其他的基因。對于這整個過程具體是怎么進行的，我們依然所知甚少。雖然我們已經(jīng)取得了一些非凡的成功，比如克隆羊之類的攪得世界天翻地覆的事。7/27/2023為什么克隆羊的成功如此讓科學家們興奮呢？這主要是對于大多數(shù)哺乳動物而言，已分化的細胞，不再能轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋偷募毎?。換句話說，它們已經(jīng)被固定了，猶如大樹上伸展的枝椏，無論這枝椏多么壯觀，但是它們注定了不是主干，只有主干才能發(fā)出所有的枝椏。維爾穆特和克隆羊“多莉”在一起

7/27/2023干細胞如同樹木的主干一樣，也有許多層次。所以有全能干細胞、多能干細胞和專能干細胞這些不同的分類。7/27/2023干細胞(stemcell)定義：干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。

7/27/2023胚胎干細胞研究在倫理、道德和宗教方面遇到很大的障礙。3.胚胎干細胞研究的倫理挑戰(zhàn)7/27/20231）胚胎干細胞的來源是否符合法律與道德？2）胚胎干細胞的應用是否會引起倫理及法律問題？3）該項研究是否會導致人流泛濫？或?qū)е箩t(yī)生刻意造成胚胎流產(chǎn)？4）如何看待克隆人的研究？

3.1存在的問題7/27/20231）認為胚胎干細胞研究破壞人類生命，其觀念基于人類生命起始于早期胚胎。2）天主教派極力反對胚胎干細胞研究，認為用人類胚胎干細胞進行研究是一種“邪惡”。

3.2反對者的觀點7/27/2023科學界和病人組織強烈呼吁政府支持這項研究。2001年4月，JamesWatson博士(DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)明人、冷泉港實驗室主任)倡導發(fā)起了由80位諾貝爾獎獲得者參加的簽名運動，呼吁政府支持干細胞研究。3.3支持者的觀點7/27/20234干細胞生物學

干細胞是個體發(fā)育和組織再生的基礎(chǔ)，特定組織通過使自身細胞死亡和增生的方式保持組織細胞數(shù)量動態(tài)平衡的特征稱組織自穩(wěn)定性。7/27/20231．干細胞的形態(tài)特征①干細胞形態(tài)共性：細胞呈圓形或卵圓形，體積小，核質(zhì)比大，增殖力強。②干細胞的固定組織位置：有的干細胞有固定存在部位與方式。如表皮干細胞與其周圍的子細胞形成增殖結(jié)構(gòu)單元。但許多組織的干細胞沒有這種分布特點。4.1干細胞的形態(tài)和生化特征

7/27/2023①端粒酶活性高：如造血干細胞具癌細胞的端粒酶活性，增殖能力強。隨著增殖與分化，端粒酶活性下降。②蛋白標志分子：不同干細胞有各異的蛋白質(zhì)標志分子，可作為確定干細胞位置、分離提純干細胞的標志。如：巢素蛋白—神經(jīng)干細胞；角蛋白15—表皮干細胞。

2．干細胞的生化特性7/27/20231)干細胞增殖速度慢：細胞動力學研究表明，干細胞的增殖速度較慢，組織中快速分裂的細胞是過渡放大細胞。如小腸干細胞的分裂速度(Tc=11h)比過渡放大細胞(Tc≥24h)慢一倍。1.增殖緩慢性4.2干細胞的增殖特征7/27/20232)過渡放大細胞：過渡放大細胞是介于干細胞和分化細胞之間的過渡細胞，過渡放大細胞經(jīng)若干次分裂產(chǎn)生分化細胞。通過這種方式，機體可用較少干細胞獲得較多分化細胞。7/27/20233)干細胞增殖緩慢的意義：(1)利于干細胞對外界信號作出反應，以決定細胞的發(fā)展方向—增殖或分化。(2)減少基因突變的危險。增殖緩慢使干細胞有時間發(fā)現(xiàn)并糾正處于增殖周期過程中的錯誤。7/27/20231)自穩(wěn)定性：自穩(wěn)定性是干細胞的基本特征之一。指干細胞可在個體生命過程中自我更新并維持其自身數(shù)目恒定。干細胞的自穩(wěn)定性是區(qū)別腫瘤細胞的本質(zhì)特征。干細胞通過其特有的分裂方式維持自穩(wěn)定性。2.干細胞的自穩(wěn)定性7/27/20232)干細胞的分裂方式干細胞有對稱與不對稱兩種分裂方式。對稱分裂：干細胞

分裂干細胞干細胞對稱分裂：干細胞

分裂分化細胞分化細胞不對稱分裂：干細胞

干細胞分化細胞分裂7/27/2023不對稱分裂的結(jié)果使兩個子細胞一個成為功能專一的分化細胞；另一個保持干細胞的特征。3)不對稱分裂發(fā)生原因：①系列基因調(diào)控。②細胞質(zhì)物質(zhì)不均等分配。7/27/20234)無脊椎動物通過不對稱分裂維持自穩(wěn)定性。如：果蠅的Insc基因是感官前體細胞的不對稱分裂的調(diào)控基因之一，通過三個途徑進行調(diào)控：不對稱分配質(zhì)膜上的細胞定向決定因子。不對稱分配細胞內(nèi)的mRNA。決定細胞分裂時紡錘體的取向。7/27/20235)哺乳動物的種群不對稱分裂。(1)種群不對稱分裂：哺乳動物有幾種不同的干細胞群，分裂后產(chǎn)生不同細胞。干細胞→分化細胞干細胞→干細胞→祖細胞3→分化細胞祖細胞1→分化細胞祖細胞2→分化細胞7/27/2023(2)哺乳動物種群不對稱分裂的意義：①使機體對干細胞的調(diào)控更靈活，以適應機體的生理變化。②要求機體對干細胞分裂的調(diào)控更精確，以保持干細胞數(shù)目恒定。7/27/2023(3)哺乳動物種群不對稱分裂的調(diào)控。哺乳動物通過多層次多角度調(diào)控，保持自穩(wěn)定性。正調(diào)控：促進與細胞增殖、生存有關(guān)的基因表達。負調(diào)控：促進與細胞凋亡有關(guān)的基因表達。如轉(zhuǎn)基因小鼠長期造血干細胞高表達Bcl-2后，使長期造血干細胞的數(shù)目顯著增加。說明細胞凋亡也是干細胞的調(diào)控方式。

7/27/2023根據(jù)其分化潛能大小，干細胞可分為三類:

全能干細胞多能干細胞專能干細胞1.干細胞的分化潛能4.3干細胞的分化特征

7/27/20231)全能性干細胞(胚胎干細胞)：具有形成完整個體的分化潛能。如胚胎干細胞(ES)具有很強的分化能力，可無限增殖并分化為全身200多種細胞類型，及機體的各種組織、器官。7/27/20232)多能性干細胞：多能干細胞具有分化出多種細胞組織的潛能，但失去了發(fā)育成完整個體的能力。如骨髓多能造血干細胞，它可分化出至少十二種血細胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細胞。7/27/20233)專能性干細胞(成體干細胞)：專能干細胞(也稱單能、偏能干細胞)，這類干細胞只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細胞分化。如上皮組織基底層的干細胞、肌肉中的成肌細胞(衛(wèi)星細胞)。7/27/20231)干細胞的轉(zhuǎn)分化：一種組織類型的干細胞在適當條件下分化為另一種組織類型的細胞的過程稱干細胞的轉(zhuǎn)分化。2.干細胞的轉(zhuǎn)分化和去分化7/27/2023實驗：C57BL/6J♂成年小鼠造血干細胞WBB6F/J-KitW/KitW-V♀鼠(亞致死劑量同位素照射)在♀鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中檢測到Y(jié)染色體.即♂鼠的造血干細胞移植到♀鼠中分化為腦星形膠質(zhì)細胞。移植分離3天7/27/20232)干細胞去分化：一種干細胞向其前體細胞的逆向轉(zhuǎn)化稱干細胞去分化。實驗：成體鼠造血干細胞鼠卵泡的內(nèi)細胞團表達胎鼠的珠蛋白基因→參與胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育。注入分化狀態(tài)逆轉(zhuǎn)7/27/20231)干細胞的橫向分化：在干細胞移植時，供體干細胞在受體中通常分化為與其組織來源一致的細胞。但有時供體干細胞會分化出與其組織來源不一致的其它細胞，這種現(xiàn)象稱干細胞橫向分化(trans-differentiation)。3.干細胞的可塑性7/27/2023干細胞橫向分化表明成體干細胞被移植入受體中具有很強的可塑性。為干細胞治療提供了可能。2)實驗：小鼠肌肉干細胞→體外培養(yǎng)5天＋少量骨髓間質(zhì)細胞接受致死量輻射的小鼠中各種血細胞系。植入分化7/27/20233)橫向分化的調(diào)控機制：與干細胞的微環(huán)境有關(guān)。干細胞進入新的微環(huán)境后，對分化信號的反應受到周圍正在進行分化細胞的影響，從而對新的微環(huán)境中的調(diào)節(jié)信號做出反應。7/27/20231．胚胎干細胞：從囊胚期(受精后5~7天)胚胎分離到的干細胞稱胚胎干細胞。2．胚胎干細胞的特性：為全能性干細胞。有如下特性：可在體外無限增殖并保持未分化狀態(tài)。具有分化為完整個體的潛能。具有分化為所有種類的細胞、器官的潛能。5胚胎干細胞7/27/20233．胚胎干細胞的研究價值：是發(fā)育生物學基礎(chǔ)研究的理想模型和有效工具。研究細胞分化研究基因功能研究基因表達7/27/20235.1人胚胎干細胞的獲得要研究胚胎干細胞，首先要獲得胚胎干細胞。(一)獲得途徑：主要有：從早期胚胎獲得2.從原始生殖細胞獲得3.從移植細胞(克隆細胞)獲得7/27/20231．從早期胚胎獲得美國Thompson研究小組是從囊胚期胚胎的內(nèi)細胞團中獲得胚胎干細胞：體外受精卵囊胚期去除滋養(yǎng)層→內(nèi)細胞團得5株干細胞系

32代(8個月)保持未分化狀態(tài)。傳代培養(yǎng)發(fā)育免疫切除法7/27/20232．從原始生殖細胞獲得gearhart小組：流產(chǎn)胎兒性腺嵴原始生殖細胞獲得5個多能干細胞系7個月不分化。

思路：原始生殖細胞是未分化細胞。培養(yǎng)分離培養(yǎng)7/27/20233．體細胞移植分化細胞核(乳腺、皮膚細胞)

去核卵細胞→雜合細胞發(fā)育成囊胚胚胎干細胞成體(如多利羊)。

分離發(fā)育移植刺激7/27/20231.形態(tài)和生化特征1)形態(tài)：細胞體積小，核大，1~多個核仁。離體培養(yǎng)可產(chǎn)生密集的多細胞克隆。2)生化特征：端粒酶活性高。3)干細胞物理特性：如干細胞對Hoechst33324和Rhodamine123染料不著色。5.2胚胎干細胞的主要特征7/27/20234)干細胞表面免疫原性：一般表達胚胎早期的表面抗原，而且有種屬差異。如小鼠胚胎干細胞表達胚胎階段性特異抗原-1(SSEA-1)，不表達SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干細胞表達SSEA-3或SSEA-4。7/27/20232.干細胞的分離與純化1)借助細胞的生化特征及物理特性，采用熒光細胞分離器從單細胞懸液中即可分離純化干細胞;2)干細胞的理化特征與其分化調(diào)控有關(guān)，如上皮干細胞高表達β1整合素，介導干細胞與細胞外基質(zhì)粘附，抑制干細胞分化。7/27/20233.干細胞的體外培養(yǎng)由于干細胞數(shù)目少，應用時需先在體外進行非分化性增殖，再進行誘導分化。不同組織來源的干細胞的培養(yǎng)條件不盡相同。7/27/20231)培養(yǎng)條件：需要許多生長因子和間質(zhì)細胞的共培養(yǎng)。如Brustle等在體外培養(yǎng)了鼠的ES細胞。分離ES細胞培養(yǎng)培養(yǎng)生長增殖保持分化潛能。停止供給生長因子，ES細胞分化為寡樹突細胞或星狀細胞。EGF培養(yǎng)基FGF2+PDGFFGF2培養(yǎng)基7/27/20232)分化誘導在應用前還需依據(jù)靶組織類型對培養(yǎng)干細胞進行定向分化誘導。分化誘導需了解：①干細胞發(fā)育有關(guān)的信號調(diào)節(jié)；②干細胞發(fā)育的微環(huán)境。7/27/20234.胚胎干細胞的分化潛能胚胎干細胞是全能(多能)性干細胞，具有分化為各種組織細胞的潛能。7/27/2023實驗：移植實驗人胚胎干細胞小鼠體內(nèi)畸胎瘤(良性)→有三個胚層產(chǎn)生的組織：移植發(fā)育胃上皮(內(nèi)胚層)骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌等(中胚層)神經(jīng)表皮、神經(jīng)節(jié)復層磷狀上皮等(外胚層)7/27/20236.精原干細胞精原干細胞來自原始生殖細胞。胚胎外胚層原始生殖細胞雙側(cè)生殖腺嵴生精索(

曲細精管)

生精母細胞(精原干細胞的前體細胞)

成體精原干細胞分化分化遷移發(fā)育形成空隙sertoli前體細胞7/27/20236.1精原細胞的增殖和

干細胞的再生1．精原細胞的形態(tài)特征：精原細胞緊貼于曲細精管的基膜，圓形或卵圓形，φ12μm，核大，除核糖體外其它細胞器不發(fā)達。7/27/20232．精原細胞的增殖與類型：精原細胞分為A型和B型。A型：常染色質(zhì)豐富，核仁常靠近核膜，根據(jù)在曲細精管局部的排列特征，又分為Asingle、Apaired和Aaligned三種類型。B型：分化型精原細胞。7/27/20231．分化Aal型精原細胞A1型精子A1型精原細胞是精子形成的不可逆的調(diào)控點。機體對這一調(diào)控點有相當嚴格的控制。分化分化6.2精原細胞的分化及其控制7/27/20232．分化控制(1)精原細胞分化抑制的影響因素：動物模型研究表明，精子發(fā)生存在可逆性抑制，使A1型精原細胞不分化而增殖。其影響因素如sertoli細胞的中毒、輻射損傷、維生素缺乏甚至睪丸溫度升高等。7/27/2023(1)

細胞毒性藥物致分化抑制sertoli細胞毒性藥物2，5-己二酮小鼠A1型精原細胞不能分化。用促性腺激素釋放激素的激動劑治療后，藥物導致的分化抑制得以緩解。說明激素水平可以調(diào)節(jié)生殖細胞的分化。作用5周7/27/2023(2)

Kit受體的作用①Kit受體：即干細胞生長因子受體。屬于生長因子受體類的原癌基因產(chǎn)物。②作用：原始生殖細胞表達Kit受體，sertoli細胞分泌干細胞因子(SCF)。SCF通過與Kit受體結(jié)合促進細胞增殖。7/27/2023③干細胞因子：有兩種形式在已二酮(hexanedione)導致精子發(fā)生衰退的大鼠中，sertoli細胞表達可溶性因子，經(jīng)激素治療后，膜包被型數(shù)量增加?？扇苄痛龠M增殖膜包被型促進分化7/27/2023(3)

VitA的作用VitA缺乏→精細胞退化，補充VitA或維甲酸→分化重新開始推測：A型精原細胞中有維甲酸的核內(nèi)受體，因此維甲酸對A型精原細胞有作用，但這種作用依賴sertoli細胞。7/27/20233.精原細胞的凋亡精子發(fā)生過程中通過細胞凋亡調(diào)節(jié)分化型精原細胞的密度。分化型精原細胞在曲細精管不同部位差別很大，但原始生殖母細胞密度變化很小，是因為分化型的精原細胞在不同部位選擇性地凋亡。7/27/2023精子發(fā)生過程中的凋亡相關(guān)基因

凋亡促進基因：ICE(IL-1-βconvertingaenzyme)

bax,p53,ICH-1，fas等。凋亡抑制基因：bcl-2,crmA等。7/27/20237成體干細胞成體組織或器官中，許多細胞仍具有自我更新及分化產(chǎn)生不同組織細胞的能力，如血液細胞、皮膚細胞、受損的肝組織細胞等。這些細胞即是成體干細胞.7/27/20237.1造血干細胞造血干細胞是第一種被認識的組織特異性細胞。1961年Till和McCulloch首次通過小鼠脾集落形成實驗證實造血干細胞在成體內(nèi)的存在。7/27/20231．形態(tài)：一般認為造血干細胞的形態(tài)類似小淋巴細胞。2．細胞表面標志：表面標志比較多，臨床上應用最多的是CD34。還可與KDR(kinaseinsertdomainrecepter)配合鑒定造血干細胞和造血祖細胞。造血干細胞：CD34+KDR+造血祖細胞：CD34+

KDR-7/27/20233．造血干細胞的胚胎發(fā)生中胚層細胞造血環(huán)境(大動脈、性腺脊、中期腎區(qū))

胎肝髓系及淋巴系的前體細胞骨髓遷移出生前遷移遷移分化7/27/20234．造血干細胞的調(diào)控(1)維持造血干細胞的數(shù)目恒定：干細胞因子(2)影響干細胞的移行、數(shù)目維持、分化：成纖維細胞生長因子(FGF-1，F(xiàn)GF-2)、SDF-1、細胞外基質(zhì)。7/27/20237.2間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcell，MSC)

7/27/20231．間充質(zhì)干細胞的位置間充質(zhì)干細胞附著于骨髓竇的內(nèi)腔面，形成一種包埋于竇狀網(wǎng)絡(luò)中的三維細胞網(wǎng)絡(luò)。7/27/20232．MSC的分離與表面標志(1)分離：骨髓抽提物取1.073/ml密度界面上的細胞，貼壁生長的細胞中95~98%為MSC。根據(jù)細胞表面抗原獲得MSC。7/27/2023(2)MSC的特異性表面標志通過流式細胞儀分析，間充質(zhì)干細胞特異性表面抗原有：SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。7/27/20233．間充質(zhì)干細胞的分化方向間充質(zhì)干細胞可分化為多種間充質(zhì)組織。如骨、關(guān)節(jié)、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基質(zhì)等。來源不同或在不同條件下，間充質(zhì)干細胞可分化相應組織細胞。7/27/2023如骨髓中的間充質(zhì)干細胞可分化脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞。在含有1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、地塞米松、吲哚美辛的培養(yǎng)基中，95%間充質(zhì)干細胞分化為脂肪細胞。在含TGF-β3的無血清培養(yǎng)基中，間充質(zhì)細胞會分化為軟骨細胞。7/27/2023由于間充質(zhì)細胞在體外可以相對容易地誘導出骨細胞、軟骨細胞，可在骨損傷、先天性骨畸形有治療中有廣泛應用。7/27/20237.3神經(jīng)干細胞傳統(tǒng)觀點：神經(jīng)細胞無再生能力。新發(fā)現(xiàn)：中樞神經(jīng)系統(tǒng)中部分細胞仍具有自我更新及分化產(chǎn)生成熟腦細胞的能力，這些細胞被稱為神經(jīng)干細胞。7/27/20231．神經(jīng)干細胞的存在部位哺乳動物中腦側(cè)室的室管膜下區(qū)包括室管膜的細胞中存在有增殖能力的干細胞。成體的下腦室區(qū)、嗅球及海馬區(qū)是神經(jīng)干細胞存在的部位。7/27/20232．神經(jīng)干細胞的生化特性神經(jīng)干細胞表達巢素蛋白，所有的神經(jīng)干細胞都巢素蛋白陽性。巢素蛋白的表達始于神經(jīng)胚形成期，當神經(jīng)細胞遷移基本完成后，合成開始下降，神經(jīng)細胞完成分化，巢素蛋白表達停止。7/27/20233．神經(jīng)干細胞的維持與分化(1)促進細胞增殖的因素：表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)，對干細胞的存活、增殖和分化起重要作用。EGF的主要作用是維持神經(jīng)干細胞生存；

FGF-2主要是對細胞分化起作用。7/27/2023(2)促進神經(jīng)干細胞分化的因素：小牛血清。用小牛血清替代EGF培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，細胞分化為星形膠質(zhì)細胞、少突狀細胞和神經(jīng)元；巢素蛋白逐漸減少，出現(xiàn)神經(jīng)元特有的微管結(jié)合蛋白–2及膠質(zhì)細胞的特征性神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白。7/27/20237.4表皮干細胞7/27/20231．表皮干細胞的存在部位(1)表皮干細胞位于表皮基底層。屬于專能干細胞。能周期性的進入分化程序，最終分化為角質(zhì)細胞。(2)表皮增殖單位：位于基底層的干細胞和分布在它周圍的由它分裂形成的子細胞，共9個，組成一個柱狀細胞群，稱為一個表皮增殖單位。7/27/2023(3)表皮干細胞的分化：表皮增殖單位邊緣的子細胞脫離基底膜后向上遷移經(jīng)過棘細胞層和顆粒層細胞，最終形成角質(zhì)化無核細胞。這層細胞不斷脫落，由新生的細胞不斷補充。人體不同部位的皮膚更新速度約2~4周。在細胞遷移過程中，角質(zhì)化伴隨著分化過程。7/27/20232．表皮干細胞的生化標志

(1)表達角蛋白5(keratin5，K5)