流式細胞術質量控制

流式細胞術質量控制流式細胞術（flowcytometry,FCM）越來越廣泛的應用在臨床檢驗中。由于臨床檢驗本身的性質，它要求臨床檢驗的管理者和操作人員必須把好常規(guī)操作已經(jīng)結果分析的質量關。同時還必須懂得如何判斷分是在控還是失控。作為臨床檢驗工作，其工作的質量標準就是使檢驗的結果最佳地符合病人有無病變的實際情況。在臨床檢驗中分為分析前、分析中、分析后的質量控制。分析前的質量控制主要內(nèi)容是標本采集、保存和傳送等；分析中的質量控制即實驗操作過程的控制；分析后的質量控制主要是對數(shù)據(jù)結果的處理，對檢驗結果的可信度評價和及時將報告送給臨床并聽取反饋意見。為此，從臨床醫(yī)師開出化驗單，，直至拿到檢驗報告的整個過程都在質量控制的范疇之中，即所謂全程質量控制。它包括質量保證、質量控制和質量評估。質量保證，指圍繞所有的步驟，監(jiān)測和評估實驗室規(guī)章制度與操作流程的效力。主要利用質量控制和質量評估。質量控制指建立一套完善的實驗室監(jiān)控方法，保證結果的可靠性，提高準確度、精密度、重復性和室間結果的可比性。對于一個實驗，應建立一套包括各種可變因素（儀器設備、樣本處理、試劑、操作過程、數(shù)據(jù)分析等）的操作規(guī)程。質量評估是由一個區(qū)域性的、國家的或國際性的機構，組織通過一系列的方法來比較實驗室內(nèi)或不同實驗室之間的結果而建立的一套評價系統(tǒng)。其主要目的是建立室間和儀器設備之間的可比性。當一個標準品或參考標準存在時，質量評估通常被稱為熟練度測試。因此，嚴格的質量控制是先進的臨床檢驗分析技術真正發(fā)揮作用的保證。FCM作為一項先進的檢測技術，對質量控制自然也不例外。目前，F(xiàn)CM應用于臨床檢驗的項目主要集中在幾個方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴細胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27檢測、陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）的檢測等等。2,細胞DNA、RNA檢測及細胞周期分析，包括DNA倍體檢測、細胞周期分析、網(wǎng)織紅細胞檢測、網(wǎng)織血小板檢測等等。3,定量分析，包括愛滋病劃分中外周血CD4的絕對定量、OKT3治療監(jiān)測中CD3的絕對定量、干細胞移植中的CD34的定量等等。FCM實驗的質量控制自然也包括儀器設備、樣本處理、試劑、操作過程、數(shù)據(jù)分析等整個實驗過程的質控。一、 流式細胞儀的校準流式細胞儀的校準包括流路的穩(wěn)定性、光路的穩(wěn)定性、多色標記熒光顏色補償、光電倍增管轉換的線性和穩(wěn)定性。對儀器的校準主要是利用標準微球進行監(jiān)測。聚苯乙烯可以被做成各種大小的微球，也可被熒光標記或者擁有定量免疫球蛋白的結合位點。這種制成固定熒光強度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球,已成為流式質控中的一個常用的標準品oBECKMANCOULTER公司擁有儀器校準所需全部標準微球（見表一）。另外，在顏色補償方面，BECKMANCOULTER公司的流式細胞儀除了可以用標準補償試劑來完成外，還可以直接利用生物樣品進行自動顏色補償，這使多色標記變得非常容易oBECKMANCOULTER公司的流式細胞儀所帶的全程質控軟件，使日常儀器性能的質控以及質量控制評估都可自動完成。二、 實驗操作過程的質控（一）樣本的質量控制用于流式分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、組織活檢物、漿膜腔積液、腦脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物）、細針穿刺物等等。樣本的條件控制可能是免疫表型分析質控最困難的環(huán)節(jié)之一。每種樣本都有不同的采集、保存、運輸和制備要求。首先，觀測樣本外觀：有嚴重溶血、凝聚或壞死的樣本應棄用。第二，單細胞懸液的獲?。和庵苎凸撬璐┐桃簽樘烊粏渭毎麘乙?；活檢組織常用機械分離和酶消化兩種方法。不同的實驗要求適用不同的方法。對于需要進行膜抗原標記的，不僅是要獲得足夠的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結構的完整性和抗原性，機械法較適用。只需進行細胞周期或DNA倍體分析的，在機械法的基礎上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）較適用。第三，抗凝劑的選擇：外周血標本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數(shù)和流式分析，則應用EDTA抗凝；對于血小板分析的實驗，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細胞活性問題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。第四，樣本的保存：理想狀態(tài)下，樣本應在采集后立刻進行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通?？杀４嬷?8-72小時/室溫（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時/室溫（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小時/室溫（16-25）；對于只作胞內(nèi)染色的樣本，可固定細胞以長期保存。但此“固定－染色”的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式。第五，去除紅細胞的方法：紅細胞裂解法，操作簡單、快、并最可能保持原始標本的白細胞分布。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認：1）抗原性不被溶血過程改變；2）溶血劑被徹底洗去，細胞和抗體結合的動力反應未受影響；3）所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細胞活性及表面標記結果。密度梯度離心法，靶細胞回收較好并可能得到富集，同時去除紅細胞、碎片等，但費時，某些重要細胞群體可能被選擇性丟失。第六，細胞與抗體的比例:廠家推薦的抗體用量通常是假定靶細胞數(shù)量在5X105?1X106范圍內(nèi)。有些標本沒有足夠的細胞，有些則由于細胞量大，正常濃度下的抗體相對過量或不足，導致假陽性或假陰性結果。因此，每個實驗室應根據(jù)不同于廠家推薦的方法，調(diào)整細胞與抗體用量，得到最適的細胞/抗體比例。第七，細胞活性的鑒定:死細胞對許多抗體均有很強的非特異性染色，這就使樣本細胞活性檢測變得非常重要，尤其是經(jīng)過了長時間運輸和儲存的樣本。檢測的方法通常有兩種:1）實時的流式檢測:利用熒光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放線菌素D（7-AAD）或EMA（ethidiummonoacide）進行死細胞染色，而活細胞拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢是細胞表面標志和活性分析可同時進行。尤其適用于高度壞死的樣本。7-AAD最常用，因為在488nm激發(fā)下，其最大發(fā)射光在670nm左右，適合與FITC或PE進行多色標記。但隨著時間延長，7AAD會在固定的細胞群體重新分配，死活細胞的區(qū)分變得困難。因此，對于染色并在固定后12小時以上分析的標本，最好用EMA。EMA與死細胞DNA穩(wěn)定的共價結合保證了長時間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。2）手工檢測：使用Trypanblue或其他細胞活性染料。3）使用專門的儀器進行檢測。如Vi-cell.（二）、選擇和確定單抗組合流式分析最基本的試劑就是抗體。所選抗體的好壞直接影響結果。影響抗體特性的因素很多，如F/P比值、亞型、全長或片段、種宿來源、標記熒光種類等等。而且，有CD分類號的300多種單抗和大量沒有CD分類號的單抗使抗體的選擇更加困難。一般，選擇抗體組合遵循以下基本原則:1）所選的抗體組合應足夠寬，可以鑒別樣本中的所有細胞亞群包括正常和異常群體。2）對表達少的抗原應盡可能選擇熒光強度強的熒光素標記。3）了解不同抗體的細胞反應譜，以及染色模式。根據(jù)不同的實驗目的選擇抗體。因為相同CD編號的抗體可能識別不同的抗原決定簇。4）抗體的多種組合可能相互影響與抗原的結合（如通過空間構型的阻礙），所以對所用抗體組合，應先了解每個抗體在對照細胞上單色標記的表達情況。5）對于臨床實驗盡量選擇體外診斷（IVD）試劑和分析特異性（ASR）試劑，而僅供研究用（RUO）試劑一般不能用于體外診斷實驗。在我國，用于體外診斷的試劑還必須取得國內(nèi)的SDA認證。這樣，一個抗體組合內(nèi)的抗體可能來源不同的公司，有不同的濃度、不同的亞型、不同F(xiàn)/P值，可能均需要自身的同型對照，而實際上，這是非常困難的。那么，盡量選擇同一家公司的試劑可以減少上述的干擾。對于臨床上常見的流式檢測項目，所需的試劑組合基本都有參考或推薦的抗體組合。如，T細胞亞群檢測的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）檢測的CD55、CD59；血小板無力癥（GT）檢測的CD41、CD61等等。但對于白血病/淋巴瘤免疫分型，國際上迄今為止也沒有統(tǒng)一的抗體組合。在2000年國際細胞分析學會（ISAC）大會上，臨床血細胞計數(shù)協(xié)會組織了一次國際專家會議，以期對檢測血液淋巴系統(tǒng)腫瘤所需最少、最有效的單抗數(shù)達成共識。75%與會者一致認為，對于慢性淋巴系統(tǒng)增殖性疾?。–LD）有9種單抗：CD5,CD19,k入CD3,CD20,CD23,CD10,CD45對初診來說是最基本的。淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16種單抗。對于急性白血?。ˋL），75%的與會者認為大約13-15種單抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO,CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，對初步鑒別白血病系列是必需的。其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能對某些病例有用。幾乎所有的投票者都認為，要對急性白血病完善分類所需單抗的恰當數(shù)量平均為20-24種。但這些抗體之間組合也是一大難題，目前也無統(tǒng)一規(guī)定（如表二）。大會多數(shù)發(fā)言者（11/13）指出，對已確診病人的監(jiān)護和分期來說，僅需較少單抗。抗體的質量控制是實驗的關鍵環(huán)節(jié)?？贵w的質量包括其特異性、靈敏度、精密度。對這一些，一些商業(yè)化的公司對常用單抗的檢驗均推出了一系列質控物。如BECKMANCOULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（見表一）。（三）染色方法細胞表面染色：大多數(shù)免疫表型分析均采用此方法。但由于許多抗原也同時存在細胞內(nèi)，所以在細胞表面抗原檢測時應特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。表面標記又分溶血前標記和溶血后標記。若紅細胞對標記有影響或血漿成分對標記有影響的，適合溶血后標記，但要注意溶血劑膜抗原的影響，所以，溶血劑一般不含固定劑。如免疫球蛋白輕鏈檢測和陣發(fā)性血紅蛋白尿的檢測等。細胞內(nèi)染色：有些胞內(nèi)抗原的檢測對白血病的免疫分型尤為重要，如TdT,MPO,cCD3,cCD79a。胞內(nèi)染色的關鍵是使細胞膜通透，把抗體或核酸染料導入胞內(nèi)而不影響細胞骨架的完整性。還要保證固定和透膜的步驟不影響有關抗原與相應抗體的結合力和核酸與染料的結合。某些適用于胞內(nèi)染色的試劑可能不適于表面標記分析。通常胞內(nèi)染色不能與細胞活性的檢測同時進行，除非用EMA的方法。對于胞內(nèi)染色，所用的熒光素應足夠小到能穿透到胞膜內(nèi)。對于某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）為活細胞染料，無需固定或透膜。胞膜和胞內(nèi)染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內(nèi)染色，最后是DNA染色。三、 數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細胞儀數(shù)據(jù)的獲取必須是在儀器性能的校準均合格的基礎上進行。由于流式細胞儀是基于對散射光信號和熒光信號進行分析的儀器，因此，儀器散射光和熒光信號的光電倍增管電壓、增益、顏色補償?shù)葏?shù)的設定直接影響結果。同型對照的設定尤為重要。同型對照是指與單抗種宿來源相同、亞型相同、標記熒光素相同的未免疫動物的免疫球蛋白。同時考慮濃度、F/P值盡量相同，這樣陽性閾值的界定才比較準確，特別是對于弱表達抗原陽性率的測定。而DNA倍體分析中參照物的設定非常重要，一般雞紅細胞作為內(nèi)參照物。為了結果的可靠性，對獲取的細胞量至少應在10000-20000個。但不同的實驗目的對于獲取的細胞量要求一般是不一樣的，如DNA倍體分析，至少應獲取10000個細胞；微小殘留病灶（MRD）的檢測，要求達到10-4數(shù)量級水平，則應至少分析100000個細胞；干細胞移植中CD34的檢測，應至少獲取100個CD34陽性細胞或75000個有核細胞。對于獲取的數(shù)據(jù)，應保存在listmode文件中，便于分析。設門（gating）對于流式數(shù)據(jù)分析至關重要。設門實際就是確定分析區(qū)域。在DNA倍體分析中，設門實際就是圈定單個細胞，排除粘連細胞。對于細胞成分單一的標本（如培養(yǎng)細胞），設門比較簡單。但對于成分復雜的標本（如骨髓）而言，準確的設門就不那么簡單。前向散射光（FS）與側向散射光（SS）設門干擾因素較多，目前，越來越多的被免疫標記物加散射光設門所取代。如,CD45/SS設門已成為白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34檢測、MRD監(jiān)測最佳的設門方法；CD19/SS設門對于成熟B淋系增生性疾病分析非常適用。在數(shù)據(jù)分析中，百分率、熒光強度、DNA指數(shù)（DI）、多少個/ul是我們報告中常用的。百分率主要適用于檢驗指標集中在細胞有無的數(shù)量變化。如T細胞亞群檢測、網(wǎng)織紅細胞檢測等；熒光強度主要適用于檢驗指標的變化集中在細胞上抗原量的多少。如血小板無力癥（GT）的檢測、慢性淋巴細胞白血病（CLL）CD20的變化等。DI用于DNA倍體分析。而愛滋病劃分中外周血CD4的絕對定量、OKT3治療監(jiān)測中CD3的絕對定量、干細胞移植中的CD34的定量等等，最終都以多少個/ul的濃度形式表示出來。對于白血病/淋巴瘤免疫分型結果的分析，以前基本上都是以百分率的形式報告臨床，但單純的百分率結果并不能完整的反映腫瘤細胞的特性。因為20%人為認定的陽性判斷標準忽略了低于20%的弱陽性結果，以及忽略了陽性結果之間熒光強弱的差別，而這一切對于白血病/淋巴瘤的診斷和分型卻非常重要。目前，大多主張以文字描述抗原有無和強弱的報告方式，廢棄百分率的報告形式。四、 臨床檢驗的分析過程的質量評價質量控制也必須重視檢驗方法學的選擇和評價。任何一次實驗都一定有誤差，在一定意義上可以將誤差分為實驗方法學的系統(tǒng)誤差及除此之外的隨機誤差。質