NIYU分子生物學(xué)第九章分子生物學(xué)技術(shù)課件

第十章分子生物學(xué)技術(shù).分子生物學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)產(chǎn)生了一整套分子生物學(xué)技術(shù)。幾乎在一夜之間，這一技術(shù)已經(jīng)成了研究許多基本生物學(xué)問題的重要手段。通過對DNA或RNA的提取，基因的分離，核苷酸序列的測定，人們將了解到基因及其所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對其功能也有所認(rèn)識。通過對基因的表達(dá)的研究，我們能了解基因的表達(dá)調(diào)節(jié)過程，進(jìn)一步認(rèn)識生命活動的規(guī)律。通過對基因進(jìn)行突變和改造，我們將深入了解基因及其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。.基因克隆(genecloning)基因表達(dá)(geneexpression)-原核基因表達(dá)

-真核基因表達(dá)第一節(jié)基因的克隆與表達(dá).概述克隆載體受體細(xì)胞體外重組的策略基因克隆工作流程基因克隆.一、分子克隆的概念基因克?。ǚ肿涌寺olecularcloning）、重組DNA或基因工程都是指DNA的無性繁殖技術(shù)----通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，擴增形成大量子代分子的過程。

基因克隆的核心-----體外重組(Recombination):人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。.基因克隆的技術(shù)路線目的基因載體體外重組轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代DNA體外重組重組子（雜合DNA）受體細(xì)胞..二、克隆載體理想的載體應(yīng)具備以下幾個條件：能夠自我復(fù)制；分子量要小，小分子DNA易處理，不易損傷，而且小分子質(zhì)粒為多拷貝質(zhì)粒，可用于基因擴增；能給受體細(xì)胞提供可選擇的標(biāo)記；對多種限制酶只有單一的切點，否則切割重組后可能丟失某些片段。.三、受體細(xì)胞（外源DNA導(dǎo)入的細(xì)胞，是重組體擴增的場所）1、轉(zhuǎn)化：重組DNA分子必須進(jìn)入宿主細(xì)胞中，才能得到擴增和表達(dá)，這個過程叫做轉(zhuǎn)化。2、要求：易于接納外源DNA;無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶;載體復(fù)制、擴增不受阻;與載體有互補性大腸桿菌是目前使用最廣泛的宿主細(xì)胞。除此以外，其它細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞等也可作為宿主細(xì)胞，可以根據(jù)實驗的需要加以選擇。在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中，不同的單個細(xì)胞（在平板上表現(xiàn)為單個菌落，亦稱克?。┲锌赡芎胁煌闹亟M質(zhì)粒或非重組質(zhì)粒，因此必須進(jìn)行篩選，以便確定哪些是重組克隆。篩選可以使用抗菌素抗性或其它方法，依載體的性質(zhì)而定。.四、體外重組的策略1、粘末端連接1）全同源粘末端連接最方便簡單高背景-載體自身環(huán)化雙向插入2）定向克?。菏雇庠椿蚨ㄏ虿迦氲捷d體中的克隆策略粘-粘連接：最有效、最快捷粘-平連接：適用于外源基因僅與載體有一個相同酶切位點，可將另一末端補平.2、平末端連接：酶切點為平末端或任何兩個末端補平的DNA效率低，酶用量大3、人工接頭連接人工接頭：人工合成含有酶切位點的寡核苷酸片段4、T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的T，PCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個A.五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得1、構(gòu)建基因組文庫2、構(gòu)建cDNA文庫3、PCR4、RACE技術(shù)5、人工合成6、差異顯示.1、構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因

基因組文庫(genelibrary)：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。特點及應(yīng)用：包含所有遺傳信息；構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）；篩選難度大；用于研究基因在基因組中的情況.構(gòu)建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）.經(jīng)體外包裝，感染大腸桿菌寄主細(xì)胞為了使真核基因組DNA克隆到cosmid載體上，首先用核酸內(nèi)切酶Sau3A局部消化基因組DNA，然后分離收集分子量為35~45kb的片段群體，并用已經(jīng)Sau3A處理的Cosmid載體DNA進(jìn)行連接重組柯斯質(zhì)粒（cosmid）.2、構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因

cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細(xì)胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。

特點及應(yīng)用：

cDNA文庫僅包含正在表達(dá)的基因；不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選...3、PCR擴增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因以基因組DNA為模板，直接進(jìn)行PCR擴增較難多采用以mRNA為模板的RT-PCR法.

利用特異引物和mRNA的PolyA

(3‘

RACE)或5’端(5‘RACE)互補的通用引物，合成全長cDNA。主要步驟：（1）獲得高質(zhì)量總RNA（2）去磷酸化快速擴增cDNA末端4、RACE技術(shù)（RapidAmplificationofcDNAEnd）.（3）去帽子結(jié)構(gòu)

（4）在mRNA5’端連接特異性RNA寡聚接頭.（5）以特異性寡聚dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生可用于RACE的具有已知5’和3’末端的cDNA第一鏈（6）分別以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行RACE反應(yīng).5、mRNA差別顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR（mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionPCR）基本原理是將具有可比性的細(xì)胞在某一條件下可表達(dá)的mRNA群體通過逆轉(zhuǎn)錄方法變成相應(yīng)的cDNA群體，以此為模板，利用一對特殊引物，即3’anchor引物和5’arbitrary引物，在一定條件下進(jìn)行PCR擴增，得到與mRNA相對應(yīng)的“標(biāo)簽”（tags），然后用變性聚丙烯酰胺測序膠分析其差別，將有差別的基因克隆化，進(jìn)一步分析其結(jié)構(gòu)與功能。.以一個被克隆的特定標(biāo)記作為探針去篩選基因文庫中所有DNA片段染色體步行法染色體步行(chromosomewalking)6、圖位克隆(map-basedcloning)目的基因.30%Fraryetal.,2000.SCIENCE289:85-88fw2.2:Aquantitativetraitlocuskeytotheevolutionoftomatofruitsize.（二）體外重組連接體系的建立：溫度：粘末端連接：12-18℃

平末端連接：室溫（低于30℃)DNA量：載體分子數(shù)/目的基因分子數(shù)=1：1-3酶量：平端連接時需加大酶量.（三）轉(zhuǎn)化—Cacl2法、電擊法（四）重組子的篩選及鑒定1、篩選：平板法（抗生素、藍(lán)白斑）；原位雜交2、鑒定：長度鑒定：酶切、PCR；方向鑒定：聯(lián)合酶切、測序.一．表達(dá)系統(tǒng)：

基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達(dá)載體及受體細(xì)胞。基因的表達(dá)

GeneExpression.據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1．原核表達(dá)系統(tǒng)：將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達(dá)系統(tǒng)：使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。.1、原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。2、原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。3、一般不含內(nèi)含子，沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。5、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：啟動子、終止子6、與轉(zhuǎn)譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)——核糖體結(jié)合位點：轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUG或GUG、SD順序二．原核表達(dá)系統(tǒng)（一）原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點.（二）外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件：1、刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)2、外源基因置于強啟動子和SD順序控制下3、維持正確開放閱讀框架（ORF）4、mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解

.（三）影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素1、啟動子：建立表達(dá)載體時，選擇強啟動子。常見原核強啟動子：Plac：受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受IPTG的誘導(dǎo)Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動子和Trp啟動子的雜合啟動子。PL和PR啟動子：噬菌體早期左/右向啟動子，受λ噬菌體CI基因負(fù)調(diào)控。溫度誘導(dǎo)。2、基因劑量：3、核糖體結(jié)合位點：SD順序與16srRNA3’末端互補程度；AUG—SD間距離；AUG后的核苷酸.（四）原核表達(dá)載體：適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。主要元件：強啟動子；SD順序；篩選標(biāo)志；其它調(diào)控基因類型：融合型表達(dá)載體：----融合蛋白非融合型表達(dá)載體：---天然完整蛋白分泌型表達(dá)載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙.融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點加人工合成的DNA接頭構(gòu)建位相載體.----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA

載體部分序列DNA序列.位相載體----含有3種讀碼框的系列載體優(yōu)點：表達(dá)效率高產(chǎn)物穩(wěn)定

易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性.Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：pGEX-1T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子位相載體融合型載體----pGEX系列.非融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因主要元件：強啟動子；SD；ATG：第一個密碼子.非融合型表達(dá)載體----pPL-LamdaPL啟動子---溫度誘導(dǎo)插入位點--HpaI.分泌型表達(dá)載體：1、主要元件：啟動子；SD序列；信號肽序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點：分泌表達(dá)，避免降解。

分泌型表達(dá)載體----pINIII-ompA1.分泌型融合表達(dá)載體----pEZZ18.（五）提高表達(dá)水平的手段1、選擇合適載體，提高翻譯水平強啟動子----提高轉(zhuǎn)錄水平核糖體結(jié)合位點（ATG---SD）避免產(chǎn)物降解：分泌/融合表達(dá)；細(xì)菌蛋白酶抑制劑2、選擇合適宿主

Lac啟動子----LacI菌；PL/PR-----CI857溶源菌3、誘導(dǎo)表達(dá)溫度誘導(dǎo)------PL/PR；IPTG的化學(xué)誘導(dǎo)----Plac、Ptac

4、提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解.（六）表達(dá)產(chǎn)物的檢測：

1、特異性鑒定：熒光抗體法；免疫沉淀法；免疫印跡法；ELISA2、生物學(xué)活性鑒定

（七）原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點1、沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識別、剪除內(nèi)含子2、缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工.三、真核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢：1.

具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)2.

具翻譯后修飾系統(tǒng)3.

可實現(xiàn)真正的分泌表達(dá)4.基因治療.（一）真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點真核基因組的復(fù)雜性真核基因組龐大，具大量非編碼序列---mRNA豐度不同結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體---表達(dá)調(diào)控多樣不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子沒有操縱子結(jié)構(gòu)

（二）真核表達(dá)系統(tǒng)組成：真核表達(dá)載體；受體細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)移方式據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為3種：酵母表達(dá)系統(tǒng)；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng).（三）轉(zhuǎn)化1、原生質(zhì)體法：去除厚壁2、電穿孔法：效率較高（四）外源基因的表達(dá)1、胞內(nèi)表達(dá)2、分泌表達(dá)：在MCS前加入信號肽序列（五）缺點不能實現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能.第二節(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)歷史60s-70s：基因的體外分離技術(shù)。Khorana（1971）：美國MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴增最早設(shè)想遺忘:當(dāng)時很難進(jìn)行測序和合成寡核苷酸引物；當(dāng)時(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能。.KaryMullis(1985)發(fā)明過程：Mullis在“偶然想出的聚合酶鏈反應(yīng)”一文中寫到:“這種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公路上時想出來的”。發(fā)展過程：開始使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，該酶不耐熱，每次加熱變性DNA后都要重新補加。耗時、費力、易出錯。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得自動化。PCR發(fā)展速度：驚人，沒有一種技術(shù)能與之相比；引用論文最多、應(yīng)用范圍十分廣泛。1993年度諾貝爾化學(xué)獎：Mullis，與開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”加拿大籍英國科學(xué)家MichaelSmith共獲。.一、PCR技術(shù)的基本原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)③引物的延伸：重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的新鏈，而這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增幾百萬倍。.(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)..二、PCR反應(yīng)條件與反應(yīng)體系1、溫度與時間的設(shè)置：①變性溫度與時間：一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。②退火(復(fù)性)溫度與時間：取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)，復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。.③PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。2、循環(huán)次數(shù)：決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。.溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。.3、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10×擴增緩沖液10ulMg2+1.5mmol/L4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5u加雙蒸水至100ul.PCR的反應(yīng)動力學(xué)

PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴增量可用下式計算：Y＝(1＋X)nY代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”。PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點，保而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。..三、PCR擴增產(chǎn)物的分析PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。1、凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、EB染色后于紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致。2、酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。3、分子雜交：4、核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。.第三節(jié)核酸的分子雜交

核酸分子雜交技術(shù)(hybridization)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

這一技術(shù)是分子克隆技術(shù)的重要組成部分，在基因的表達(dá)調(diào)控和物種的親緣關(guān)系研究中也發(fā)揮重要作用。核酸的分子雜交有不同的形式和方法，下面介紹常用的幾種。.一、Southern分子雜交（薩瑟恩DNA印跡雜交）

根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。

.DNA樣品用一種或幾種限制性內(nèi)切酶消化后，DNA片段按照分子量的大小在電泳凝膠中進(jìn)行分離。凝膠經(jīng)過變性處理(通常加入堿性緩沖液)，使其中的DNA雙鏈分子變性為單鏈，然后利用毛細(xì)管作用原理或其它物理方法，將疑膠中的單鏈DNA分子轉(zhuǎn)移并固定到固相支持物表面上(一般為硝酸纖維素膜或尼龍膜)，此時的DNA片段還保留著原來在凝膠中的分布圖式。用一段放射性標(biāo)記的核苷酸序列(稱之為探針)與膜上的DNA片段雜交。那么，與探針有同源性的DNA片段在膜上的位置便可通過放射自顯影而得以了解。

（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片...SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。.二、Northern分子雜交技術(shù)（諾賽恩RNA印跡技術(shù)）

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。mRNA樣品經(jīng)過電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與放射性標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行雜交，經(jīng)過放射自顯影，特異的mRNA分子在樣品中的存在與否、長度大小以及量的多寡便可得知。Northern分子雜交技術(shù)已廣泛用于研究特異的mRNA分子在細(xì)胞處于不同條件下發(fā)生的量和質(zhì)的變化或不同組織器官中基因表達(dá)的差異。..三、蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Westernblotting）

將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，即可用來檢測相應(yīng)抗原(蛋白質(zhì))的存在，這種技術(shù)叫Westernblotting。.四、原位雜交技術(shù)

是指在細(xì)胞、組織切片上直接進(jìn)行分子雜交，通過檢測細(xì)胞內(nèi)特異mRNA的存在與否，它能夠告訴我們，在哪些細(xì)胞中有特異基因的表達(dá)。要進(jìn)行原位雜交，首先要進(jìn)行組織的固定，常用的有甲醛、戊二醛等交聯(lián)固定劑。以后依次經(jīng)過脫水，石蠟包埋和切片，組織樣品的準(zhǔn)備就算完成。原位雜交所用的探針要短，這樣才能盡量使探針摻入細(xì)胞內(nèi)。同時，在雜交進(jìn)行以前常用蛋白酶消化，使細(xì)胞的空隙增大，從而提高探針對靶子mRNA序列的可接近度。原位雜交所需雜交液的用量很小，雜交反應(yīng)可在蓋玻片下進(jìn)行。與前面所介紹的分子雜交技術(shù)不同，原位雜交的放射自顯影不是利用X-光片而是將乳膠涂在切片上，經(jīng)過曝光、顯影、定影來完成。然后，進(jìn)行組織切片的化學(xué)染色，便可觀察到切片組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及放射自顯影信號在。.四、菌落雜交法（噬菌斑雜交）.第四節(jié)DNA的序列分析

有兩種DNA測序的方法：Maxam-Gilert法和Sanger終止法。

一、Maxam-Gilert法的原理.二、Sanger終止法的測序原理

DNA的酶促合成源于不斷加入的核苷酸上的5’磷酸基團(tuán)與增長鏈上的3’OH基團(tuán)間的磷酸二酯鍵的形成。這個過程一直進(jìn)行到DNA的全長合成完畢。雙脫氧核糖核苷酸(dideoxynucleotide)沒有3'OH，相應(yīng)位置被3’H所取代。在存在雙脫氧核糖核苷酸時，DNA合成會由于二磷酸鍵無法形成而停止，鏈增長在該點結(jié)束，在3’端的最后一個堿基就是該雙脫氧終止子。Sanger測序法的這種修飾叫做雙脫氧終止法測序(dideoxyterminationsequencing)。.

...DNAmicroarray第五節(jié)生物芯片（biochip）技術(shù).利用人工合成8-25n的寡聚核苷酸探針.DNAmicroarray.利用cDNA探針..利用ORF（openreadingframe)DNA探針.第六節(jié)基因敲除（geneknockout）技術(shù)一、完全敲除Gancyclovir：丙氧甲基鳥嘌呤HSV-TK：herpessimplexvirusthymidinekinase單純皰疹病毒胸苷激酶Neor：Neomycinresistance新霉素抗性...二、條件型基因敲除Cre/LoxP系統(tǒng)組織特異性敲除..形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記分子標(biāo)記數(shù)十種技術(shù)問世，萬變不離其宗：分子雜交、PCR擴增第一類：電泳、分子雜交為核心，代表：RFLP、DNA指紋第二類：電泳、PCR為核心，代表：RAPD、SSR、AFLP第三類：DNA序列為核心，代表：ITS測序分析第七節(jié)分子標(biāo)記及其應(yīng)用.分子標(biāo)記優(yōu)點數(shù)量豐富、信息量大；與生長發(fā)育無關(guān)，取材不受限制；較多共顯性，信息量完整在真核生物中，基因組DNA多態(tài)性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于各種基因的遺傳多態(tài)性，因為基因組中存在著大量的不編碼的DNA序列，它們的變異不受或較少地受自然選擇的制約.分子標(biāo)記應(yīng)用種質(zhì)資源研究品質(zhì)純度鑒定（包括DNA指紋鑒定）構(gòu)建遺傳連鎖圖基因定位（QTL）標(biāo)記輔助選擇比較基因組研究基因克?。▓D位克隆）生物起源、進(jìn)化、醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué).RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)byBotstein(1980)A1ecJcffreys等從人的染色體DNA中分離出一種中度重復(fù)序列作為探針，對人的染色體DNA進(jìn)行RFLP分析(稱為DNA指紋)。他們將總DNA用限制性內(nèi)切酶完全酶解以后，用放射性的探針進(jìn)行Southern印跡，每個人的DNA所產(chǎn)生的陽性雜交條帶都是特異性的，而且子女的陽性雜交條帶中，有一半與父親的DNA陽性雜文帶相同，另一半是與來自母親的陰性雜交條帶相同。用這種中度重復(fù)序列作為探針，對不同的人的DNA進(jìn)行指紋分析，產(chǎn)生完全相同的圖譜的機會小于60億分之一，因此這一方法用于法醫(yī)鑒定，血緣關(guān)系的識別等。..基本原理：物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)記的DNA作探針，把與被標(biāo)記DNA相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。.優(yōu)點:共顯性，非常穩(wěn)定缺點：檢測步驟多，周期長，費時、費錢；用作探針的DNA克隆制備、保存不方便；放射性同位素自從人的RFLP圖譜構(gòu)建后，又分別構(gòu)建了果蠅、牛、大豆、小麥、水稻等多種生物的RFLP圖譜。..RAPD(RandomAmplifiedPolymorphismDNA)

與常規(guī)PCR的不同A.引物長度短常規(guī)PCR中需要兩個引物，長度20-30個核苷酸。RAPD只需一個引物，長度9-10個核苷酸，而且是隨機引物。B.退火溫度低RAPD引物短，因此退火溫度要低，一般為35-37℃。.隨機擴增多態(tài)性DNA.通用性--實驗步驟少，省工、省力、進(jìn)度快--不需先知道基因組的任何分子信息--所用材料不需有性世代，可用任何單一親本、任何部位的材料，在沒有有性世代的線粒體、葉綠體DNA研究中也可使用；--引物沒有嚴(yán)格的種屬界限，同一套引物可用于任何一種植物的研究，具有廣泛性和通用性。.植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用用于種屬特異性鑒定外源導(dǎo)入基因的追蹤遺傳作圖RAPD標(biāo)記從理論上講是無限的，而且在端粒及重復(fù)順序上可以找出RAPD標(biāo)記位點，因此可以做出很密集、很詳細(xì)的遺傳圖來。鑒定染色體上特異的DNA片段，進(jìn)行基因定位和分離RAPD易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，敏感性高?？烧页雠c靶基因連鎖的RAPD標(biāo)記，進(jìn)行基因定位。.AFLP(AmplifiedRestrictionfragmentpolymorphism)瑞士Zabeau等1992年發(fā)明，結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)的特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)高效性?；驹恚簩蚪MDNA進(jìn)行酶切，連上雙鏈人工接頭，根據(jù)接頭的核苷酸序列和酶切位點設(shè)計引物，進(jìn)行選擇性擴增。它將RAPD隨機性和專一性擴增巧妙結(jié)合，再選用內(nèi)切酶以達(dá)選擇的目的。三個步驟：(1)DNA酶切及人工接頭連接，對提取DNA質(zhì)量要求較高，需避免其它DNA污染和抑制物質(zhì)的存在；(2)擴增反應(yīng)；(3)通常在4％-6％的變性聚丙烯酰胺凝膠上分離.擴增片段長度多態(tài)性.特點--理論上，可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇堿基的種類、數(shù)目很多，所以標(biāo)記數(shù)目是無限的。--每次譜帶在50-100條之間，多態(tài)性檢測非常有用--呈典型的孟德爾方式遺傳--可用于作為遺傳圖譜和物理圖譜的位標(biāo)。--可用于分析基因組DNA、克隆的DNA大片段，—對模板濃度不敏感，即使模板濃度存在差異，也會得到強度一致的譜帶。.缺點專利技術(shù)，試劑盒價格貴；需要同位素或非同位素標(biāo)記引物，須具特殊防護(hù)措施、配套儀器設(shè)備；基因組的不完全酶切會影響實驗結(jié)果，所以實驗對DNA純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高。.SSR（SimplesequenceRepeat）=(microsatellite)=(ShortTandemRepeat,STR)SatelliteDNA：真核生物基因組酶切、離心后，在主帶附近會出現(xiàn)（AT）含量很高的簡單高度重復(fù)序列。MicrosatelliteDNA：一類由幾個核苷酸（一般1-5個，基序很短）為重復(fù)單位串聯(lián)而成的DNA序列。繼RFLP之后的第二代分子標(biāo)記,多態(tài)性好、重復(fù)好、共顯性標(biāo)記.微衛(wèi)星簡單重復(fù)序列.特點微衛(wèi)星DNA廣泛存在：人和動物（TG）n，植物（AT）n微衛(wèi)星DNA長度的多態(tài)性微衛(wèi)星DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列原理根據(jù)兩端序列的保守性，設(shè)計引物；進(jìn)行PCR，電泳分離，染色顯帶以檢測微衛(wèi)星序列多態(tài)性。應(yīng)用構(gòu)建遺傳連鎖圖；種質(zhì)資源鑒定；標(biāo)記輔助育種；基因診斷與治療：一些人類基因病的產(chǎn)生與三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)有關(guān)。.其他簡單序列重復(fù)區(qū)間（Inter-simpleSequenceRepeat,ISSR)序列標(biāo)記位點（Sequence-TaggedSites,STS)小衛(wèi)星DNA（MinisatelliteDNA)單鏈構(gòu)型多態(tài)性（Single-strandComformationPolymorphism,SSCP)變性梯度凝膠電泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE).SNP（simplenucleotidepolymorphisms）

單核苷酸多態(tài)性.思考題1、核酸分子雜交技術(shù)的基本類型及原理2、核酸測序的原理3、RACE技術(shù)原理4、PCR技術(shù)原理5、基因克隆的一般程序6、什么是基因文庫？什么是基因組文庫？cDNA文庫同基因組文庫有何差別？建立cDNA文庫的主要實驗步驟7、對感興趣的目的基因進(jìn)行圖位克隆的一般程序8、分離核酸原則及分離提取核酸的主要步驟9、DNA芯片的概念、制作流程及應(yīng)用10、何謂分子標(biāo)記，分子標(biāo)記的種類有哪些?可以開展哪些領(lǐng)域的研究.補充：核酸的提取和純化要進(jìn)行分子生物學(xué)研究，首要任務(wù)就是從組織或細(xì)胞中提取核酸。一、核酸的提取1、DNA的提取DNA的提取沒有統(tǒng)一的方法，但它們的第一步都是將細(xì)胞破碎，然后去除蛋白質(zhì)以及多糖等的污染。DNA在體內(nèi)通常都與蛋白質(zhì)相結(jié)合，蛋白質(zhì)對DNA制品的污染常常影響到以后的DNA操作過程，因此，需要把蛋白質(zhì)除去。一般采用苯酚氯仿抽提的方法。苯酚—氯仿對蛋白質(zhì)有極強的變性作用，而對DNA無影響。經(jīng)苯酚—氯仿抽提后，蛋白質(zhì)變性而被離心沉降到酚相與水相的界而，DNA則留在水相，這一方法對于去除核酸(無論是DNA或RNA)中的大量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)行之有效，因此也是一個基本方法。DNA制品中也會有RNA雜質(zhì)，但RNA極易降解，況且，少量的RNA對DNA的操作無大影響，必要時可加入無DNA酶的RNA酶以去除RNA的污染。.

DNA的提取其最根本的要求是保持核酸的完整性。在提取DNA的過程中有許多因素能導(dǎo)致DNA降解成小片段：①物理因素降解。因為DNA分子量較大，機械張力或高溫很容易使DNA分子發(fā)生斷裂。因此在實際操作時應(yīng)盡可能輕緩，盡量避免過多的溶液轉(zhuǎn)移，劇烈的振蕩等，以減少機械張力對DNA的損傷，同時也應(yīng)避免過高的溫度。②細(xì)胞內(nèi)源DNA酶的作用。細(xì)胞內(nèi)常存在活性很高的DNA酶，細(xì)胞破碎后，DNA酶便可與DNA接觸并使之降解。為了避免和鈍化DNA酶的作用，在溶液中常加入EDTA，SDS以及蛋白酶等。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNA酶的輔因子。SDS和蛋白酶則分別具有使蛋白酶變性和降解的作用。③化學(xué)因素也會降解DNA。如過酸的條件下，由于DNA脫嘌吟而導(dǎo)致DNA的不穩(wěn)定，極易在堿基脫落的地方發(fā)生斷裂，