凝膠過濾層析法教學專用課件

凝膠過濾層析法凝膠過濾層析

（分子篩層析、排阻層析）

7/29/20231一、凝膠過濾介質凝膠過濾(gelfiltration)是利用凝膠的網(wǎng)狀結構根據(jù)被分離物質分子大小進行分離的一種方法。凝膠過濾的優(yōu)點：1、介質為不帶電的惰性物質，不與溶質分子作用，分離條件溫和，收率高，重現(xiàn)性好2、工作范圍廣，分離分子量的覆蓋面大3、設備簡單，易于操作，周期短，可連續(xù)使用。7/29/20232凝膠過濾介質應具備的條件1、介質本身為惰性物質，在應用過程中它不與溶質、溶劑分子發(fā)生任何作用2、應盡量減少介質內含的帶電離子基團，以減少非特異吸附性，提高蛋白質的收率3、介質內孔徑大小要分布均勻4、凝膠珠粒大小均勻5、介質要具有優(yōu)良的物理化學穩(wěn)定性及較高的機械強度，易于消毒，延長了介質的使用壽命7/29/20233常見的凝膠種類1、多糖類骨架的介質：以天然多糖為母體的凝膠過濾介質，這類介質具有親水性及與生物大分子的相容性，可允許生物大分子透過而不發(fā)生變性。這類介質的缺點是多為軟基質，壓力降大時不易操作。因此在經(jīng)典的多糖類介質的基礎上又生產(chǎn)出剛性、半剛性的骨架和瓊脂糖與葡聚糖接枝而成的復合凝膠(超膠Superdex)高效介質。7/29/20234凝膠過濾介質的種類2、合成大分子骨架的介質：選用高親水性單體，經(jīng)共聚反應而合成的多孔結構過濾介質。主要產(chǎn)品有聚丙烯酰胺類、聚乙烯醇系及羥甲基酰胺類。3、天然大分子與合成高聚物構成混合骨架的介質7/29/20235主要凝膠過濾介質的牌號及骨架結構7/29/20236主要的凝膠過濾介質(一)、葡聚糖系1、葡聚糖系—Sephadex結構：以氯代環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑的葡聚糖珠狀凝膠，依據(jù)孔徑不同形成G型凝膠系列產(chǎn)品，G后數(shù)字表示凝膠的吸水量，是其吸水量的10倍。G也表示凝膠交聯(lián)度的大小，G越小，交聯(lián)度越大，孔徑越小，排阻的分子越小。7/29/202377/29/202382、性能：(1)溶脹性Sephadex系均以干態(tài)供應，使用前必須在過量的溶劑中充分溶脹后才能使用。(2)化學穩(wěn)定性Sephadex不溶于一切溶劑，在水、鹽溶液、有機溶劑、堿及弱酸溶劑中均較穩(wěn)定。因葡聚糖中的糖苷鍵在強酸中可發(fā)生降解作用，所以只能接觸強酸的稀溶液，在0.1mol/L鹽酸中可接觸1～2小時，在0.02mol/L鹽酸中經(jīng)6個月均無明顯變化，但要避免作用氧化劑。7/29/20239(3)物理穩(wěn)定性pH中性濕態(tài)珠體可經(jīng)受120℃、30min高壓滅菌而不影響色譜性能(4)機械強度Sephadex凝膠的機械強度取決于交聯(lián)度，交聯(lián)度越大，機械強度越高。機械強度與柱床所能承受的壓力有關，其壓力與流速的關系為：V=K×ΔPLV：線速度，cm/h；ΔP：壓力降，cm水柱；L：床高；K：比滲透率，受粒徑影響較大。7/29/202310葡聚糖凝膠(G)型號分離范圍(分子量)吸水量(克／克干凝膠)膨脹體積(毫升／克干凝膠)浸泡時間蛋白質多糖20～25℃90~100℃10<700<7001.02-33115<1500<15001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-407257/29/202311Sephadex的型號及性能7/29/2023123、主要用途：孔徑較小的凝膠主要用于脫鹽、肽與其他小分子的分離；孔徑較大的凝膠用于蛋白質與其他大分子的分離。DNA級的Sephadex適用于DNA或低聚核苷酸的分離。4、衍生系：在經(jīng)典葡聚糖凝膠的基礎上，引入特殊基團后生成葡聚糖凝膠的衍生系，主要有LH系，如以G25為母體引入羥丙基成LH20，以G50為母體引入羥丙基成為LH60。特點是LH系除具有凝膠過濾的作用外，同時具有分配層析及吸附層析的作用。7/29/202313Sephadex經(jīng)改性后比其母體具有更廣泛的用途，適用于脂類、甾類、脂肪酸、激素、維生素及其他小分子的分級分離。LH系列主要用途：①用于有機溶劑中的凝膠過濾，尤其適用于嗜脂性分子及制備各種天然產(chǎn)物；②結合凝膠過濾、分配層析及吸附層析的特點，能分離結構非常相近的分子及其他凝膠難以處理的樣品；③

排阻極性與原母體凝膠相同。LH20對芳香多環(huán)化合物的分離比LH60好而LH60更適用于分配層析。④對樣品的負載量大，負載量可高達300mg/ml凝膠。7/29/202314(二)、瓊脂糖系由經(jīng)過純化的瓊脂糖制備，其中含有極小的帶電基團。利用瓊脂糖熱溶液冷卻時可凝膠化的特點，能方便地制成珠狀物。在凝膠過程中由單獨的多糖鏈先形成雙螺旋，然后聚集成膠束。膠束之間有孔，孔的大小取決于膠束的多少即瓊脂糖的濃度。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠非特異性吸附極低，分離范圍很廣，分離范圍從10000～40000000，所以適用于分子量差距較大的分子間分離，分辨率不很高。瓊脂糖凝膠有兩種牌號Bio－GelA系和Sepharose7/29/2023157/29/202316Bio－GelA系型號及性能7/29/202317Sepharose系型號能性能7/29/202318Sepharose是該系中最早的產(chǎn)品，為非交聯(lián)結構，因此不能進行高壓滅菌，僅能在2～40℃范圍內使用。根據(jù)瓊脂糖含量的不同，對含量為2％、4％及6％的產(chǎn)品分別命名為2B、4B和6B。由于新型凝膠的不斷出現(xiàn)，此型凝膠有逐漸被淘汰的趨勢。7/29/202319SepharoseCL是瓊脂糖珠體與2，3－二溴丙醇反應后具有共價交聯(lián)鍵的產(chǎn)物。交聯(lián)結構大大提高了珠體的熱穩(wěn)定性及物理化學穩(wěn)定性，但對孔結構無明顯影響。交聯(lián)后凝膠在還原條件下經(jīng)堿水解去除了硫酸根，減少了帶電基團，使非特異吸附比其母體小。凝膠在中性條件下可經(jīng)受120℃消毒，處理后其色譜性能不變。特別適用于含有機溶劑的分離，流速比傳統(tǒng)的Sepharose有明顯提高并可廣泛用于離子交換劑及親和吸附劑的母體。7/29/202320Superose由珠狀瓊脂糖經(jīng)過兩次交聯(lián)而制備的新型凝膠。用含雙環(huán)氧基及多環(huán)氧基的混合長交聯(lián)劑對瓊脂糖珠體進行第一階段交聯(lián)，然后再與含雙環(huán)氧基的短鏈交聯(lián)劑進行第二次交聯(lián)。經(jīng)兩次交聯(lián)反應后的珠體大大提高了介質的剛性和增強了物理化學穩(wěn)定性。用0.1mol/L的HCl溶液及0.1mol/L的NaOH在40℃處理兩周，色譜性能無明顯變化，還可經(jīng)受70％甲酸及30％乙腈處理。7/29/202321Superose為剛性－半剛性珠體，在高黏性液體如8mol/L尿素下也能保持適當流速將廣泛的分離范圍及高分辨率集于一身，適用于糖類、核酸、病毒等的分離，特別是包含體蛋白在促溶劑中的純化。能一次性分離生物分子大小差異較大按的混合物。由于顆粒細小，粒度分布均勻，柱效高，可允許高流速，適用于中、高壓層析系統(tǒng)分離。7/29/202322SepharoseFastFlow是新型的BioProcess凝膠介質，經(jīng)過高度交聯(lián)的瓊脂糖珠體。具有機械強度高、流速快、極高的物理化學穩(wěn)定性及非特異性吸附極低等特點，而適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)使用。對蛋白質的回收率很高，并可用多種促溶劑及有機溶劑或1～2mol/L的NaOH進行清洗。7/29/202323(三)、聚丙烯酰胺系由丙烯酰胺與N,N’－亞甲基雙丙烯酰胺共聚而成的親水性凝膠。是結構穩(wěn)定的合成高聚物，不受微生物侵蝕，可在120℃消毒30min后，色譜性能不變。干膠的羧基含量≤3.0mmol/g，含有極少的游離電荷，所以非特異性吸附很小。還可以通過改變交聯(lián)劑的用量控制凝膠孔徑的大小，得到不同排阻極限的系列產(chǎn)品。7/29/2023247/29/202325Bio－GelP類凝膠7/29/202326(四)、Sephacryl系列由烯丙基葡聚糖與N,N’－亞甲基雙丙烯酰胺經(jīng)共聚而成的一種共價交聯(lián)的剛性珠體，有6種不同的分離范圍，具有廣闊的選擇性，具有良好的機械性能，可進行快速的高分辨率的純化。其穩(wěn)定性能可用0.5mol/L的NaOH進行清洗及再生。由于其化學穩(wěn)定性，使其既適用于水溶液，又可用于多種有機溶劑體系。可在科研及工業(yè)生產(chǎn)中應用。7/29/2023277/29/202328Sephacryl系列產(chǎn)品性能7/29/202329(五)、Superdex系列產(chǎn)品是最新的凝膠過濾介質，屬BioProcess介質中的一種。是將葡聚糖以共價鍵方式結合到高交聯(lián)的多孔瓊脂糖珠體上形成的復合凝膠。是將交聯(lián)葡聚糖優(yōu)良的過濾選擇性及高交聯(lián)的瓊脂糖的物理化學穩(wěn)定性集于一身的具有優(yōu)良選擇性和高分辨率的產(chǎn)品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃處理400小時而分辨率保持不變。7/29/202330Superdex結構7/29/202331Superdex(BioPrecess介質)素列產(chǎn)品性能7/29/202332(六)、聚乙烯醇系(Toyopearl)：以交聯(lián)聚乙烯醇為骨架的凝膠過濾介質，20世紀80年代初部世，由美國R&H公司與日本曹達公司聯(lián)合開發(fā)。是多孔的三維網(wǎng)狀結構，大分子鏈上含有豐富的羥基，使其具有高度親水性，進行化學改性后可轉變?yōu)楹卸喾N功能基的離子交換劑及親和吸附劑。FractogelTSK是該系列的類似產(chǎn)品，適用于HPLC(高效液相層析)。7/29/202333Toyopearl系型號及性能7/29/202334二、分子篩原理7/29/2023357/29/2023367/29/202337凝膠層析中常用的術語和參數(shù)7/29/202338床體積：膨脹后的基質在層析柱中所占有的體積（Vt）表示。Vt=V0+Vi+Vg內水體積：是層析基質顆粒內部所含水的體積，用（V0）表示。外水體積：層析基質顆粒之間所含水的體積，用（Vi）表示?；|體積：層析基質本身在層析柱中所占有的體積（Vg）表示。7/29/202339膨脹度：在一定溶液中，單位重量的基質充分溶脹后所占有的體積，用Vg表示。即每克溶脹所具有的床體積。分配系數(shù)：指一組分在固定相與流動相中含量的比值。7/29/202340凝膠過濾的分配常數(shù)Kav=

Vt-VoVe-Vo在給定的條件下，Vt和Vo都為恒定值，而Ve隨著分離物分子質量的變化而變化。對凝膠過濾，其分配常數(shù)應在0≥Kav≥1。當被分離物質完全排阻時，Kav等于0，Ve等于V0；當被分離物質自由擴散時，Kav等于1，Ve等于Vo＋Vi。7/29/202341從上式可以看出，Ve、Vo可通過層析過程中測定，只要測出Vt即可計算出Kav。Vt是凝膠過濾柱床總體積，由三部分組成，即Vo＋Vi＋Vg。

Vt＝πr2h或用Vt＝Vo＋Vi＋VgVg很小，可忽略不計。V0一般用藍色葡聚糖2000測定，其分子是為200萬，呈藍色，在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可直接觀察。7/29/202342Vi的測定：選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測出洗脫體積，減去V0就是Vi。常用鉻酸鉀來測定，鉻酸鉀為黃色化合物，可直接觀察，優(yōu)點為不與葡聚糖起任何反應；也可用硫酸銨測定，用硝酸銀檢出洗脫峰。7/29/202343常用參數(shù)：

1/2h0.607h7/29/202344如圖所示為一色譜流出曲線：7/29/202345基線：在正常的操作條件下，僅有流動相（無被分離樣品）通過檢測器時所產(chǎn)生的信號。層析峰：樣品從洗脫開始到樣品流出層析柱時，檢測器對層析樣品和層析時間所產(chǎn)生的信號。峰高：峰的最大值到峰底的距離。峰寬：層析峰半高峰時的寬。峰面積：峰與峰底間的面積。7/29/202346層析峰區(qū)域寬度半峰寬：峰高一半處的峰寬度。峰寬：峰的基線寬度，通過層析峰兩側拐點作切線交于基線上的距離。標準差：樣品組分被帶出層析柱的分散度，用σ表示。兩側拐點之間的距離為2個標準差。Wb=4σ=1.699W1/2W1/2=2.354σ7/29/202347保留值：表示樣品中各組分在層析柱中停留時間的長短或組分流出時所需流動相體積的大小。保留時間和保留體積：樣品組分通過層析柱出峰所需的時間稱保留時間；樣品組分通過層析柱出峰時所需流動相的體積稱保留體積。7/29/202348死時間或死體積：柱中未被固定相所占有的空間，如柱的接口、柱出口管路、檢測器內腔空間及柱內填充空隙等稱為死體積；流動相流經(jīng)死體積所需的時間稱死時間。調整保留時間或調整保留體積：保留時間中扣除死時間后的時間；或保留體積中扣除死體積后的體積。7/29/202349分離度：指相鄰兩峰的保留時間差值是是兩峰寬平均值的幾倍。因Wb=4σ，即分離度為1時，ΔtR＝4σ。兩峰有98％分離。Rs＝＝

tR2-tR1?(W1+W2)

2(tR2-tR1)

W1+W2當W1=W2，且峰面積相等時

Rs＝ΔtR/W7/29/202350柱效：層析過程是一個連續(xù)過程，流動相不斷流過，在任何一點上實際上都無法獲得平衡，當流動相通過柱的一定高度，在離開這段柱時，流動相中某組分的平均濃度與固定相中的平均濃度可以達到分配平衡，完成這一平衡所需要的柱長稱為理論塔板等效高度，簡稱板高N=L/H7/29/2023517/29/202352凝及的選擇和處理凝膠的選擇1、凝膠的選擇(1)型號的選擇：選擇時主要根據(jù)凝膠的篩分范圍、凝膠分辨率及分離目的而確定。(2)粒度的選擇：2、凝膠用量的計算：根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度按以下公式計算；干凝膠用量(g)＝πr2h膨脹度(床體積/g)7/29/2023537/29/2023547/29/2023557/29/2023563、凝膠的處理：將所用的干凝膠慢慢傾入5～10倍的蒸餾水中，按凝膠本身的要求進行溶脹時間進行浸泡，棄去上層懸浮的小顆粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液在室溫下浸泡0.5h抽濾除去堿液，用蒸餾水洗至中性。注：為除去凝膠中的氣泡，可把處理過的凝膠浸泡于蒸餾水或平衡液中以抽真空的方式實現(xiàn)。也可采用加熱煮沸的方法，這種方法可在除氣泡的同時加快溶脹速度。但不能在酸或堿液中加熱。7/29/202357三、層析柱1、柱的選擇：與一般離子交換用的柱結構相同。近來多用多孔的聚乙烯片做底板，也可用尼龍濾布制成擋板?；蠲撘毫鞒龊蟮目臻g為死體積，層析的死體積越小越好。7/29/2023587/29/202359一般來說，用同樣直徑的層析柱分離兩種以上的物質時，長層析柱比短的分辨率高；用同樣長的層析柱分離兩種以上的物質時，直徑大的比直徑小的柱分辨率高。凝膠過濾柱的徑高比(D/H)一般在1:25～1:100的范圍之間，也有特殊要求的凝膠過濾的柱徑高比更大。對凝膠過濾層析柱最好有夾套，這樣可以便于溫控。7/29/2023607/29/2023617/29/2023622、裝柱3、上柱、洗脫與收集樣品的上柱量與以下因素有關：樣品檢測的靈敏度凝膠介質的性質樣品的粘度分離的分辨率混合物中各成分的性質差異7/29/202363上樣量對層析結果有直接的關系，上柱體積比上柱濃度的影響更大。7/29/202364在凝膠過濾層析中，流速是重要的參數(shù)，流速與層析的分辨率有直接的關系I、層析柱：2.6cm×85cm,流速2ml/cm2×h-1II、層析柱：2.6cm×85cm,流速25.5ml/cm2×h-1III、層析柱：2.6cm×19.5cm,流速24.5ml/cm2×h-17/29/202365在凝膠過濾層析中，樣品的粘度也是一個需要考慮的因素。一個粘度很大的樣品上柱后，樣品分子因運動受限制，進出凝膠的孔隙不易，因此峰形顯得寬而矮，有些可以分離的組分也會因此而重迭。結果如圖：7/29/202366血紅蛋白在凝膠過濾柱上的分離圖譜，層析柱：4cm×85cm,SephadexG-25;流速：180ml/cm2×h-1未加葡聚糖2000，粘度：1.0厘泊7/29/202367血紅蛋白在凝膠過濾柱上的分離圖譜，層析柱：4cm×85cm,SephadexG-25;流速：180ml/cm2×h-1加2.5%葡聚糖2000，粘度：4.2厘泊7/29/202368血紅蛋白在凝膠過濾柱上的分離圖譜，層析柱：4cm×85cm,Seph