SN0169-92出口食物中大腸菌群糞大腸菌群和大腸桿菌查驗方式

中華人民共和國進出口商品查驗行業(yè)標準查驗方式代替ZBX0900288Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━主題內(nèi)容與適用范圍桿菌的檢驗方法。本標準適用于出口食品的檢驗。設(shè)備和材料5mL10mL1mL水浴箱：±0.5℃。培育箱：36±1℃,±0.5℃。0～5℃和-15～-20℃。均質(zhì)器。乳缽和研棒。顯微鏡。稀釋瓶：100mL、200mL500mL5mm。菌落計數(shù)器。培育基及試劑)(LST)肉湯?；途G乳糖膽鹽(BGLB)肉湯。EC(EMB)。養(yǎng)分瓊脂斜面。色氨酸肉湯。Korser結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)。Butterfield生理鹽水。革蘭氏染色液。甲基紅指示劑。Voges-proskauer(V-P)試劑。樣品制備以無菌操作取有代表性的樣品。如有包裝則用75％乙醇在開口處擦拭后取樣。假設(shè)不能準時檢驗,應(yīng)將冷凍樣品置于-154℃冰箱保存。檢驗前冷凍樣品可于2～5℃18h45℃以下15min內(nèi)解凍。不同食品樣品勻液的制備4.2.1液體食物25mL225mL(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠),30cm7s251:10固體和半固體食品25g225mL8000r/min1～2min,制成1:10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。稀釋樣品勻液依據(jù)對樣品污染狀況的估量,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程15min。大腸菌群的測定MPN5.1.1對每一個樣品,選擇適宜的三個持續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每一個稀釋度接種三管月)(LST1mL。36±1℃48±2h。觀看試管的產(chǎn)氣狀況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,記錄24h48hLSTLST群陰性；如有產(chǎn)氣者,則進一步作證明試驗。大腸菌群的證明試驗5.2.13mm糖膽鹽(BGLB)肉湯管中。置BGLB36±1℃48±2h。BGLBBGLBMPNB充件)]報告每克(毫升)樣品中大腸菌群的MPN糞大腸菌群測定3mm48±2hLST管培育物移種于EC將全部接種的EC30min±0.5℃水浴24±2h。水浴箱的水平面應(yīng)高于肉湯培育基液面。應(yīng)以為44.5℃44.5℃不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性比照。EC性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陰性。MPN糞大腸菌群的MPN大腸桿菌測定將條中的EC24h,取其產(chǎn)氣管的培育物劃線接種于伊紅美藍(EMB)平板,36±1℃24±2h。檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。2如無典型菌落,則從每個平移種到養(yǎng)分瓊脂斜面上,36±1℃18～24h。將斜面培育物移種到以下培育基中進展生化試驗。7.4.136±1℃24±2hKovacs氏試劑～,上層顯現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反響。MR-VP36±1℃48±2h。以無菌操作移取1mL13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液,40％氫氧化鉀溶液和少量肌酸結(jié)晶,振搖試2h,如消滅伊紅色,為VPMR-VP48h5滴甲基紅溶液。如培育物變紅色,為甲基紅試驗陽性,假設(shè)變黃色則為陰性反響。Koser36±1℃培育96hLST36±1℃48±2h,觀看試管中是不是產(chǎn)氣。18h大腸桿菌為革蘭氏陰性。大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━靛基質(zhì)┃ MR ┃ VP ┃ 椽酸鹽┃鑒定(型別)━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━＋┃ ＋ ┃ － ┃ －┃典型大腸桿菌—┃ ＋ ┃ － ┃ －┃非典型大腸桿菌━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━＋┃＋┃－┃＋┃典型中間型－┃＋┃－┃＋┃非典型中間型━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━—┃ － ┃ ＋ ┃ ＋┃典型產(chǎn)氣腸桿菌＋┃ － ┃ ＋ ┃ ＋┃非典型產(chǎn)氣腸桿菌━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━如顯現(xiàn)上表之外的生化反映類型,說明培育物可能不純,應(yīng)從頭劃線分別,必要時做重復試驗。結(jié)果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC－－或－＋－－,再依據(jù)LSTMPN克(毫升)樣品中大腸桿菌MPN值。大腸菌群固體培育基測定法4計數(shù)8.2.11mL。1mL將冷至45±0.5℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)10～15mL心旋轉(zhuǎn)平皿,將培育基與樣液充分混勻。3～4mLVRBA36±1℃18～24h。30～150腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落四周有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為0.5mm或更大。證明VRBA10種于BGLB36±124h48h,觀看產(chǎn)氣情形。性管,應(yīng)進展革蘭氏染色,以便排解革蘭氏陽性桿菌。結(jié)果報告經(jīng)最終證明為陽性(產(chǎn)氣,革蘭氏陰性桿菌)的試管百分比乘以于條中計數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每克(毫升)樣品中大腸菌群數(shù)。,在VRBA10010BGLB6為：100×6/10×10**4/g(mL)＝×10**5/g(mL)附錄A培育基和試劑(補充件)A1月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase)20g氯化鈉 5.0g乳糖 5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)2.75g磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.75g0.1g蒸餾水將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的20mm×150mm10mL。12115min。最終±。A2煌綠乳糖膽鹽(BGAB)肉湯10.0g乳糖 10.0g牛膽粉(oxgall或oxbile)溶液％煌綠水溶液蒸餾水500mL200mL20.0gmL～975mL,調(diào)。再參加％煌綠水溶液,用蒸餾水補足到1000mL,用棉花過濾后,分裝到20mm×150mm10mL12115minA3EC胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g3號膽鹽或混合膽鹽 1.5g乳糖5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)4.0g磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.5g氯化鈉5.0g蒸餾水16mm×150mm試管(管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管),每管8mL。12115min,最終±。A4伊紅美藍瓊脂(EMB)10.0g乳糖10.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)2.0g瓊脂15.0g伊紅γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL美藍 0.065g或％水溶液13mL蒸餾水在1000mL蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂,加水補足至原量。分裝于三角燒瓶中。每瓶100mL200mL15min。最終±。使用前將瓊脂溶化,于每100mL5mL20％乳糖水溶液、2mL2％伊紅γ45～50℃傾注平皿。A5養(yǎng)分瓊脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白胨 5.0g瓊脂15.0g蒸餾水將各成分加于蒸餾水中,煮沸溶解。分裝適宜的試管。12115min。最終±。滅菌后擺成斜面?zhèn)溆谩６色氨酸肉湯胰胨或胰酪胨10.0g蒸餾水加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管,每5mL。12115min。最終±。A7MR-VP(月示)胨 7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)5.0g蒸餾水,121℃高壓滅菌15min,最終±。A8Koser磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O) 磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.0g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.2g枸椽酸鈉(含2H2O) 蒸餾水15min。最終±。A9結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g31.5g中性紅0.03g結(jié)晶紫瓊脂15～18g蒸餾水0.002g將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分攪拌,調(diào)至2min,將45～503h。A10Butterfield貯存液磷酸二氫鉀(KH2PO4)34.0g500mL將磷酸二氫鉀溶于蒸餾水中,用1mol/L175mL稀釋液取貯存液,用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器后,12115min。A11氯化鈉 8.5g蒸餾水將氯化鈉溶于蒸餾水中,12115min。A12革蘭氏染色液結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫 1.0g95％乙醇1％草酸銨水溶液將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液：碘 1.0g碘化鉀 2.0g蒸餾水完全溶解后,再加蒸餾水至300mL。沙黃復染液：沙黃 0.25g蒸餾水將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。染色法將涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染1min,水洗。1min,水洗。不要過分脫色,水洗。1min,水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。A13Kovacs對二甲氨基苯甲醛 戊醇鹽酸(濃)將對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后漸漸參加濃鹽酸即可。A14甲基紅指示劑甲基紅0.1g95％300mL300mL500mL。A15Voges-Proskauer(V-P)試劑甲液α-萘酚 5.0g無水乙醇乙液氫氧化鉀40.0g用蒸餾水加至附錄B(補充件)0.001g。━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━陽性管數(shù) ┃ ┃ 陽性管數(shù)┃━━━━━━━━━┫MPN┣━━━━━━━━━━┫MPN┃ ｜┃━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━0 0 0 ┃＜3 ┃ 2 0 0 ┃0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃1420002┃6 ┃202┃26003┃9 ┃203┃010┃3 ┃210┃1520011┃┃211┃27012┃┃212┃34013┃12┃213┃21020┃┃220┃021┃┃221┃2835022┃12 ┃222┃023┃16┃223┃42030┃┃230┃2936031┃13┃231┃44032┃16┃232┃53033┃19┃233┃━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━100┃┃300┃23101┃┃301┃3964102┃11┃302┃95103┃15┃303┃110┃┃310┃4375111┃11┃311┃112┃15┃312┃120160113┃19┃313┃93120┃11┃320┃121┃15┃321┃150210122┃20┃322┃290123┃24┃323┃240130┃16┃330┃460131┃20┃331┃132┃24┃332┃1100＞1100133┃29┃333┃━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━注:①本表承受3個稀釋度[0.1g(mL)0.01g(mL)和0.001g(mL)]31g(mL0.1g(mL0.01g(