醋酸纖維素薄膜電泳課件

血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳陳艷李秀清張偉孫金山——第三組那么什么是電泳？定義：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。

負(fù)極正極－遷移率（mobility)：表示單位電場(chǎng)強(qiáng)度粒子的速度。又叫泳動(dòng)度，用μ表示。μ＝v/E=Q/(6πrη)可知，在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可對(duì)它們進(jìn)行分離。電泳的應(yīng)用：分離各種有機(jī)物；分析某種物質(zhì)的純度及分子量。原理電泳為何能分離混合物？影響電泳遷移率的因素：1、內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的性質(zhì)和所帶電荷的多少、蛋白的大小和形狀2、外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象等電點(diǎn)（pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一pH下，蛋白質(zhì)解離為正負(fù)離子的程度及趨勢(shì)相等時(shí)，此時(shí)溶液的pH為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。pH＞pI，蛋白質(zhì)感受＂堿＂，此時(shí)它產(chǎn)生負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。pH＝pI，電場(chǎng)中不移動(dòng)。（注意：并不是說此時(shí)蛋白質(zhì)不帶電）pH＜pI，蛋白質(zhì)感受＂酸＂，此時(shí)它產(chǎn)生正電荷，向負(fù)極移動(dòng)。H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI以生物大分子為例遷移率與電荷量成正比，與相對(duì)分子質(zhì)量成反比。電壓越高，速度越快。但高電壓介質(zhì)溫度升高樣品擴(kuò)散和對(duì)流速度增加分辨率降低。低電壓會(huì)延長(zhǎng)電壓時(shí)間，但可以減少產(chǎn)熱。所以，實(shí)驗(yàn)中我們要選擇合適的電壓，同時(shí)要冷卻降溫。緩沖液的ｐH決定了生物的解離程度。對(duì)于蛋白質(zhì)和氨基酸來說，我們知道溶液的pH離等電點(diǎn)越遠(yuǎn),，所帶的凈電荷越多，遷移速度越快。因此選擇一個(gè)合適的pＨ，使各種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷數(shù)量差異越大，以利于分離。緩沖液要求性能穩(wěn)定，不易電解。同時(shí)，緩沖液的離子強(qiáng)度會(huì)對(duì)自身緩沖能力有影響。過高，緩沖能力差，過高則會(huì)阻礙分子的遷移，使樣品速度減慢。１樣品性質(zhì)２電場(chǎng)強(qiáng)度３緩沖液的性質(zhì)影響電泳分離效果的因素?zé)岵焕陔娪緹嵴舭l(fā)緩沖液，影響緩沖液的離子強(qiáng)度，甚至導(dǎo)致樣品變質(zhì)。熱會(huì)增加樣品的擴(kuò)散為了減少熱對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，可控制電泳或電流，也可安裝冷卻完散熱裝置。。４支持介質(zhì)５溫度理想的介質(zhì)：具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不帶電荷，對(duì)分離物質(zhì)無吸附作用的惰性材料。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：提高電泳分辨率電滲：降低分辨率。導(dǎo)致電滲的原因是支持介質(zhì)表面存在帶電基團(tuán)。吸附：降低電泳分辨率。（常用支持介質(zhì)中，高純度的瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠的吸附最小，醋酸纖維素薄膜次之，濾紙最大電滲作用：電滲：在電場(chǎng)作用下液體對(duì)固體支持物相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象。以紙電泳為例:正極－－－－－－－－＋＋＋＋＋＋＋＋負(fù)極表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動(dòng)

如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動(dòng)的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動(dòng)的速度減慢。

電泳技術(shù)：指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。電泳技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，重復(fù)性好。電泳分類：按裝置的差異有：薄膜電泳，垂直板電泳，平板電泳，垂直圓盤電泳和毛細(xì)管電泳按支持介質(zhì)有：１醋酸纖維素薄膜電泳：分辨率高，成本低，靈敏度高，應(yīng)用廣泛。２瓊脂糖凝膠電泳：操作簡(jiǎn)單，分辨率高，重復(fù)性好，結(jié)果可定量分析，電泳后易洗脫。３聚丙烯酰胺凝膠電泳；靈敏度高，對(duì)pH和溫度變化較溫度，應(yīng)用廣。４SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有聚丙烯酰胺凝膠電泳的所有優(yōu)點(diǎn)。５等電聚焦電泳。６雙向電泳：具有極高的靈敏度和分辨率。

氨基黑10B：藍(lán)色酸性染料，可與蛋白質(zhì)結(jié)合形成青色結(jié)合物。靈敏度為考馬斯亮藍(lán)R-250的20%?？捡R斯亮藍(lán)R-250:可通過非共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，適用于微量SDS-蛋白質(zhì)染色。銀染染色機(jī)制與攝影過程中Ａg離子的還原相似，靈敏度比考馬斯高100倍。常用于凝膠低電泳中極微量蛋白質(zhì)的染色。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的染色方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)1234血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳掌握電泳的基本原理，了解電泳儀，電泳槽的基本結(jié)構(gòu)和功能。

熟悉電泳的基本過程與定量方法。

熟悉血清電泳在臨床診斷中的作用。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH4.88～7.50之間，在pH8.6的緩沖溶液中均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所以帶電荷量也不同。此外各種蛋白質(zhì)的分子大小各有差異，因此在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度不同。分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)較快；反之，則較慢。血清中幾種主要蛋白組分：血清蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量占總蛋白的％白蛋白4.８８69,00057～72α1球蛋白5.0６200,0002～5α2球蛋白5.06300,000

4～9β球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ球蛋白6.85～7.５０156,000～950,00012～2９+白蛋白(A)α1α2

βγ緩沖液pH=8.6

pI＜pH血清蛋白均帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)在醋酸纖維素薄膜分為五條帶。電泳遷移率最大的是白蛋白，其后為α1球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白

實(shí)驗(yàn)器材電泳儀，電泳槽，濾紙，醋酸纖維素薄膜脫色搖床，染缸，點(diǎn)樣器

４x電極緩沖液：1.5mol/LTris-HCl(pH8.6)（Tris三羥甲基氨基甲烷）染色液：稱取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸餾水加至100ml。漂洗液：取甲醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾水50ml，混勻置塞試劑瓶?jī)?nèi)貯存。試劑

實(shí)驗(yàn)操作１、準(zhǔn)備

將電極緩沖液加入電泳槽的電極室內(nèi)，使正，負(fù)極室的液面等高，調(diào)節(jié)電泳支架寬度正好適合醋酸纖維素薄膜的長(zhǎng)度。用４層紗布或?yàn)V紙做鹽橋，一端浸入緩沖液中，一端搭在支架上。２、浸膜在膜條無光澤面距一端１.５cm處用鉛筆輕劃點(diǎn)樣線，浸入電極緩沖液中，至完全浸透為止（≧２０min)。用鑷子取出薄膜，點(diǎn)樣線向上平放于干凈濾紙上，用濾紙輕輕地按壓，吸去薄膜上多余的液體。３、點(diǎn)樣取少量待測(cè)血清均勻涂布在玻璃片上，用寬１cm的平整的塑料軟片末端取少許樣品，垂直輕印到薄膜點(diǎn)樣線上，形成一條細(xì)窄而均勻的直線。（注：點(diǎn)樣量不宜過多）此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。以印章法加樣時(shí)，點(diǎn)樣量不宜過多，動(dòng)作應(yīng)輕，穩(wěn)，用力不能太重。步驟。４、平衡

將膜條無光澤向下置于電泳槽支架上，點(diǎn)樣端靠近負(fù)極。薄膜兩端要緊貼濾紙，（點(diǎn)樣線不要壓在濾紙上）中間平直懸空，加蓋密封，平衡５min。５、電泳

將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.5mA/cm膜寬度，通電50min后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。步驟。６、染色

取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色５～10min。然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景無色為止?；厥掌匆?。。７、定量

將干燥的薄膜電泳圖譜入自動(dòng)掃描光密度儀內(nèi)，記錄儀上自動(dòng)繪出蛋白質(zhì)組分曲線圖。每一個(gè)峰代表一種蛋白質(zhì)組分。若使用具有電子計(jì)算機(jī)附件的自動(dòng)掃描光密度儀，可通過相關(guān)軟件的分析，直接獲得每條區(qū)帶蛋白質(zhì)的百分含量。

注意事項(xiàng)1、薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去。3、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞薄膜影響分離效果。4、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過多或過少。5、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端。6、應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色不易脫去；時(shí)間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。７、每次電泳時(shí)應(yīng)交換電極，使兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖液的正負(fù)離子相互交換，使緩沖液的pH維持在一定水平。。

電泳失敗的原因電泳圖不整齊（點(diǎn)樣不均勻，溫度過高等）各組分分離效果不佳（點(diǎn)樣過多，電流過低等）染色后蛋白區(qū)帶中間著色淺（染色試劑不足等）血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義可能相關(guān)疾病白蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑腎病綜合癥↓↑↑腎炎↑↑肝硬化↓（顯著）↑急性肝壞死↓↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑↑急性感染初期↑↑↑慢性炎癥/感染后期↑低球蛋白血癥↓意義臨床意義:血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳在臨床上常用于分析血、尿等樣品中的蛋白質(zhì)，供臨床上診斷肝、腎等疾病參考。肝炎:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白,β-球蛋白下降,γ-球蛋白升高肝硬化:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白下降明顯,γ-球蛋白極度升高腎