植物組織總DNA的提取課件

實驗十一植物組織總DNA的提取掌握用CTAB法提取植物總DNA的方法和基本原理。學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法測定DNA溶液的濃度。一、實驗?zāi)康膶嶒炇恢参锝M織總DNA的提取掌握用CTAB法提取植物總1二、實驗原理

通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細(xì)胞，由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。

CTAB,SDS等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。二、實驗原理通常采用機械研磨的方法破碎植物的組2再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入異丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于雙蒸水或TE溶液中，即得植物總DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到較純的DNA制劑。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽3

DNA的吸收光譜峰在260nm處，據(jù)計算，測定此波長下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時，雙鏈DNA含量約為50μg/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm處，在測定DNA含量時，還常計算OD260/OD280之值，如該值為1.8-2.0時，認(rèn)為已達(dá)到較高的純度，如低于此值，表明其內(nèi)含雜質(zhì)較多，可能影響酶切反應(yīng)。DNA的吸收光譜峰在260nm處，據(jù)計算，4水稻品種的幼苗葉片三、實驗材料水稻品種的幼苗葉片三、實驗材料5四、實驗器具、藥品試劑水浴鍋，研缽，微量移液器，槍頭，離心管，臺式離心機，液氮，恒溫箱，標(biāo)簽紙，紫外分光光度計，磁力攪拌機，剪刀等。2%CTAB抽提緩沖溶液，異丙醇,氯仿-異戊醇等四、實驗器具、藥品試劑水浴鍋，研缽，微量移液器，槍6

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌異丙醇沉淀DNA溶液CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解7五、實驗方法(1)2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預(yù)熱。(2)取少量葉片（約0.2g）置于研缽中，用液氮磨至粉狀；(3)在液氮揮發(fā)將盡而植物組織尚未解凍時迅即加入700μl的2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動；(4)將磨碎液分倒入1.5ml的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之二；(5)置于65℃的水浴槽或恒溫箱中，每隔10min輕輕搖動，40min后取出；1.DNA的提取

五、實驗方法(1)2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預(yù)熱8（6）冷卻2min后，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，劇烈振蕩2~3min，使兩者混合均勻；（7）放入離心機中10000rpm離心10min，與此同時，將600μl的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中；（8）用移液器輕輕地吸取上清夜，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動30sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；（6）冷卻2min后，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，9（9）10000rpm離心1min后，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；（10）60sec后，直立離心管，加入720μl的75%乙醇及80μl5M的醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中；（11）放置30min，使DNA塊狀物的不純物溶解；（12）10000rpm離心1min后，倒掉液體，再加入800μl75%的乙醇，將DNA再洗30min；（9）10000rpm離心1min后，立即倒掉液體，注意10（13）10000rpm離心30sec后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA（自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干）；（14）加入50μl0.5×TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37℃恒溫箱約15h，使RNA消解；（15）置于-20℃保存、備用。（13）10000rpm離心30sec后，立即倒掉液體，11稱取樣品，液氮研磨，加入預(yù)熱的(65℃

)CTAB及β-巰基乙醇

保溫1h,期間不停的搖均吸取上清液,移至新的離心管中,加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕緩顛倒混勻,10000rpm,10min取上清液，移至新的離心管中,加等體積氯仿：異戊醇,顛倒混勻,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的異丙醇（預(yù)冷），后4℃/-20℃保溫沉淀10000rpm,10min離心取沉淀，70%乙醇清洗兩次，吹干用TE溶解DNA,然后低溫保存稱取樣品，液氮研磨，加入預(yù)熱的(65℃)CTAB及β-巰12（1）葉片磨得越細(xì)越好。（2）移液器的使用。（3）由于植物細(xì)胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。六、注意事項（1）葉片磨得越細(xì)越好。六、注意事項13七、作業(yè)(1)本實驗所得的植物總DNA制劑中含有哪些遺傳物質(zhì)？(2)在DNA抽提過程中造成DNA分子斷裂的主要因素有哪些?(3)本實驗中所用到下列試劑的作用各是