園藝植物組織培養(yǎng)第9章課件

第九章胚培養(yǎng)第九章胚培養(yǎng)1主要內(nèi)容9.1胚培養(yǎng)的方法9.2胚柄在胚培養(yǎng)的作用和胚的早熟萌發(fā)9.3通過(guò)“胚拯救”獲得遠(yuǎn)緣雜種主要內(nèi)容9.1胚培養(yǎng)的方法9.2胚柄在胚培養(yǎng)的作用和胚的2

合子胚指的是由雌雄配子融合形成的合子繼而發(fā)育成的胚。對(duì)合子胚進(jìn)行離體培養(yǎng)的主要目的是獲得能正常生長(zhǎng)發(fā)育的植株。胚培養(yǎng)的研究已經(jīng)有1個(gè)世紀(jì)的歷史，在被子植物中，Hanning（1904）最早在無(wú)菌條件下進(jìn)行了離體胚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，他當(dāng)時(shí)所培養(yǎng)的是兩種十字花科植物-辣根菜和蘿卜的成熟胚。后來(lái)，很多研究者都由成熟胚的離體培養(yǎng)獲得了植株。Dieterich（1924）指出，在含有Knop無(wú)機(jī)鹽和2.5%-5%蔗糖的半固體培養(yǎng)基上，成熟胚能正常生長(zhǎng)，但由未成熟種子中剝離的胚不能長(zhǎng)出成熟胚的各種結(jié)構(gòu)，而是越過(guò)了正常胚胎發(fā)生過(guò)程中的若干階段，直接長(zhǎng)成幼苗，這種現(xiàn)象稱作“早熟萌發(fā)”。合子胚指的是由雌雄配子融合形成的合子繼而發(fā)育成的胚。對(duì)合子3胚培養(yǎng)方法的進(jìn)一步發(fā)展是受到了Laibach(1925,1929)的推動(dòng)，這是因?yàn)?，他首次證實(shí)了這種方法在實(shí)用上的重要價(jià)值。在宿根亞麻和奧地利亞麻的種間雜交中，Laibach發(fā)現(xiàn)所結(jié)的種子嚴(yán)重皺縮，分量很輕，不能萌發(fā)。但是，若把胚由種子中剝離出來(lái)，置于潮濕濾紙上或含有蔗糖的棉絮上，則能得到雜交植株。Laibach因此提出，在所有不能形成有生活力種子的雜交中，若把胚剝離出來(lái)置于人工培養(yǎng)基上，或許能夠起死回生。自此以后，在由于胚的夭折不能形成有生活力種子的情況下，胚培養(yǎng)即被廣泛用于產(chǎn)生雜種。胚培養(yǎng)方法的進(jìn)一步發(fā)展是受到了Laibach(1925,194胚培養(yǎng)的類型：成熟胚培養(yǎng)：成熟胚培養(yǎng)是指由成熟種子中剝?nèi)〉呐摺３墒炫吲囵B(yǎng)的目的是為了克服種子本身（特別是種皮）對(duì)胚萌發(fā)的抑制作用。成熟胚培養(yǎng)比較容易，在只含有無(wú)機(jī)鹽、蔗糖和瓊脂的培養(yǎng)基上就能長(zhǎng)成植株。未成熟胚培養(yǎng)：未成熟胚培養(yǎng)指的是未成熟種子中的胚或夭折之前的遠(yuǎn)緣雜種胚。進(jìn)行未成熟胚培養(yǎng)的目的，在前一種情況下是研究胚胎在不同發(fā)育時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)需求，在后一種情況下是避免雜種胚的夭折。未成熟胚往往不易剝離，而且只有在成分相當(dāng)復(fù)雜的培養(yǎng)基上才能長(zhǎng)成植株。未成熟胚培養(yǎng)的成功幾率主要取決于胚的發(fā)育時(shí)期。胚培養(yǎng)的類型：5Monnier（1980）對(duì)由球形期開(kāi)始發(fā)育的未成熟胚在活體和離體條件下的發(fā)育狀況進(jìn)行了比較。由他的研究可以看出，在離體條件下，胚的生長(zhǎng)過(guò)度，但發(fā)育延遲；在雙子葉植物中，一片子葉先長(zhǎng)，而不是像在活體中那樣兩片子葉同時(shí)生長(zhǎng)。另外，在離體條件下還有形成多個(gè)子葉的傾向。取決于植物的種類，胚齡的大小和培養(yǎng)基的組成，未成熟胚在離體培養(yǎng)中可能有3種不同表現(xiàn)：（1）繼續(xù)正常的胚胎發(fā)育過(guò)程，最終形成具有萌發(fā)能力的成熟胚（2）早熟萌發(fā)，形成細(xì)弱的畸形苗（3）形成愈傷組織Monnier（1980）對(duì)由球形期開(kāi)始發(fā)育的未成熟胚在活體69.1合子胚培養(yǎng)的方法9.1.1選擇植物材料

對(duì)用于胚培養(yǎng)的植物的選擇，通常是有所遇到的問(wèn)題既試驗(yàn)的目的決定的。

演示實(shí)驗(yàn)選胚易于剝離的植物，如豆科、十字花科植物成熟胚。9.1合子胚培養(yǎng)的方法9.1.1選擇植物材料7

易獲得大量的遺傳組成一致又處于同一發(fā)育期的胚的植物。（開(kāi)花和結(jié)實(shí)都十分規(guī)律的植物）

薺菜在某些方面能滿足這些要求。易獲得大量的遺傳組成一致又處于同一發(fā)育期的胚的植物。8培養(yǎng)處于一定發(fā)育時(shí)期的胚：

須對(duì)剛開(kāi)放的花進(jìn)行人工授粉。在這類研究中，最好先制成一個(gè)對(duì)照表，列出胚胎發(fā)育期和授粉后天數(shù)的相應(yīng)關(guān)系。培養(yǎng)處于一定發(fā)育時(shí)期的胚：須對(duì)剛開(kāi)放的花進(jìn)行9培養(yǎng)即將衰亡的胚：

從即將夭折的種子中獲得植株，則必須在夭折開(kāi)始之前，將種子剝離下來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)即將衰亡的胚：從即將夭折的種子中獲得植株，則109.1.2消毒

合子胚受珠被、子房的雙重保護(hù)，只需對(duì)胚珠、子房消毒即可，然后在無(wú)菌的條件下剝出合子胚直接置于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。9.1.2消毒合子胚受珠被、子房的雙重保護(hù)，只需119.1.3胚的剝離把胚從周圍組織中剝離出來(lái)子房種子胚珠胚小種子或胚很小必須借助解剖鏡進(jìn)行9.1.3胚的剝離把胚從周圍組織中剝離出來(lái)子房種子胚珠胚小12園藝植物組織培養(yǎng)第9章ppt課件13

先把消過(guò)毒的蒴果（圖10.2A）放在幾滴無(wú)菌培養(yǎng)基中。

然后切開(kāi)胎座區(qū)域，用鑷子將外壁的兩半撐開(kāi)，露出胚珠（圖10.2B)。由胎座上取下的1個(gè)胚珠放在載玻片的凹穴中（內(nèi)有1滴培養(yǎng)基），然后用一把鋒利的有柄刀片將胚珠縱切成兩半（圖10.2D)，先把消過(guò)毒的蒴果（圖10.2A）放在幾滴無(wú)菌培養(yǎng)14

魚(yú)雷形胚或更幼齡的胚位置都局限在縱向剖開(kāi)的半個(gè)胚珠之中（圖10.2D)，由于它們的綠色或由于它們透明的胚柄囊，因而透過(guò)合點(diǎn)清晰可見(jiàn)。在剝?nèi)∵@種未成熟胚的時(shí)候，將留下有胚的一半，仔細(xì)地剔除胚珠組織，即可把連著胚柄的整個(gè)胚取出。魚(yú)雷形胚或更幼齡的胚位置都局限在縱向剖開(kāi)的半個(gè)胚珠之15

在剝?nèi)≥^老的胚時(shí)，在胚珠上無(wú)胚的一側(cè)切一小口（圖10.2C)，用一根鈍頭解剖針輕壓珠被，即可把完整的胚擠出到周圍的液體中。整個(gè)操作過(guò)程（特別是在剝?nèi)∥闯墒炫邥r(shí)）必須小心進(jìn)行，以免使胚受傷。在剝?nèi)≥^老的胚時(shí)，在胚珠上無(wú)胚的一側(cè)切一小口（圖1016注意：在剝?nèi)「〉呐邥r(shí)，要避免它們?cè)诓僮鬟^(guò)程中干掉。注意：179.1.4培養(yǎng)胚乳看護(hù)培養(yǎng)

在人工培養(yǎng)基上幼齡胚通常很難培養(yǎng)。盡管培養(yǎng)基已經(jīng)有了不少改進(jìn)，但胚的夭折若發(fā)生在發(fā)育的極早期，要想拯救雜種仍有很大困難。9.1.4培養(yǎng)胚乳看護(hù)培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上18放在胚乳旁邊

在進(jìn)行未成熟胚離體培養(yǎng)的時(shí)候，如果在其周圍培養(yǎng)基上存在著來(lái)自同一物種另一種子的離體胚乳，對(duì)胚的生長(zhǎng)會(huì)有明顯的促進(jìn)作用。放在胚乳旁邊在進(jìn)行未成熟胚離體培養(yǎng)的時(shí)候，如19放在胚乳上

在某些屬間雜交中，若把雜種未成熟胚放在事先培養(yǎng)的大麥胚乳上培養(yǎng)，能夠顯著提高獲得雜種植株的頻率。例如：在大麥和黑麥屬間雜交中，采用這種方法30%-40%的雜種未成熟胚可以發(fā)育成苗，而用傳統(tǒng)的胚培養(yǎng)法則只有1%。放在胚乳上在某些屬間雜交中，若把雜種未20嵌入胚乳中

把雜種離體幼胚嵌人到由雙親之一或第三個(gè)物種的正常發(fā)育的胚珠取出來(lái)的胚乳中，然后把二者一起放在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。嵌入胚乳中把雜種離體幼胚嵌人到由雙219.1.5對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的要求Raghavan把胚胎發(fā)育過(guò)程分為兩個(gè)時(shí)期①異養(yǎng)期：在這個(gè)發(fā)育早期，胚依賴于由胚乳及周圍的母體組織中吸取養(yǎng)分。②自養(yǎng)期：在這個(gè)時(shí)期胚在代謝上亦能由基本的無(wú)機(jī)鹽和糖合成為生長(zhǎng)所需的物質(zhì)，因而在營(yíng)養(yǎng)上已相當(dāng)獨(dú)立。9.1.5對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的要求Raghavan把胚胎發(fā)22胚由異養(yǎng)轉(zhuǎn)入自養(yǎng)是胚發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，但這個(gè)時(shí)期出現(xiàn)的早晚因物種而異。

在薺菜中，胚在球形期以前肯定是異養(yǎng)的，只有到心形晚期它們才轉(zhuǎn)為自養(yǎng)。就是在這兩個(gè)時(shí)期之內(nèi)，培養(yǎng)中的胚對(duì)外源營(yíng)養(yǎng)的要求也會(huì)隨著胚齡的增加而漸趨簡(jiǎn)單。

為使胚正常生長(zhǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中必須把它們由一種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入另一種培養(yǎng)基。胚由異養(yǎng)轉(zhuǎn)入自養(yǎng)是胚發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，但這個(gè)時(shí)期出現(xiàn)23

Monnier(1976,1978)介紹了一種新的培養(yǎng)方法，用這種方法可以使50μm長(zhǎng)（球形早期）的薺菜胚在同一個(gè)培養(yǎng)皿中無(wú)須變動(dòng)原來(lái)的位置即完成全部發(fā)育過(guò)程，直至萌發(fā)。Monnier(1976,1978)介紹了一種新的培24

用于胚培養(yǎng)的無(wú)機(jī)鹽配方很多，互不相同，對(duì)其中每種成分的作用并無(wú)精確的評(píng)價(jià)。Monnier(1976)在研究各種標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)機(jī)鹽溶液（包括Knop,Heller,MS培養(yǎng)基等）對(duì)薺菜胚培養(yǎng)的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，在一定的培養(yǎng)基上，未成熟胚的生長(zhǎng)和存活之間并不存在相關(guān)性。1.無(wú)機(jī)鹽用于胚培養(yǎng)的無(wú)機(jī)鹽配方很多，互不相同，對(duì)其中每種成分25園藝植物組織培養(yǎng)第9章ppt課件26

在MS培養(yǎng)基中，未成熟胚的生長(zhǎng)情況雖然最好，但存活率卻很低。在Knop培養(yǎng)基中，雖然它的毒性最小，但胚的生長(zhǎng)情況很差。為此他變動(dòng)了ms培養(yǎng)基中每一種鹽分的濃度，以研究這類變動(dòng)的效果。在這些實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，他推出了一種新的培養(yǎng)基，在這種培養(yǎng)基上，胚的生長(zhǎng)與在MS培養(yǎng)基上一樣理想，同時(shí)存活率也很高。與MS培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)成分相比，在Monnier培養(yǎng)基中K十和Ca+的濃度較高，而NH4+的水平較低。在MS培養(yǎng)基中，未成熟胚的生長(zhǎng)情況雖然最好，但存活率卻27

據(jù)Umbeck和Norstog(1979)報(bào)道，培養(yǎng)基中的NH4+對(duì)于大麥未成熟胚的正常生長(zhǎng)和分化是必需的。當(dāng)以NO3-作為無(wú)機(jī)氮的惟一來(lái)源時(shí)，500μm長(zhǎng)的大麥胚在培養(yǎng)中只能略有生長(zhǎng)，而這主要是由于細(xì)胞伸長(zhǎng)造成的。盾片等的分化則需要有4.3-8.6mmol/LNH4+的存在。在曼陀羅和紫花曼陀羅中，特別是對(duì)未成熟胚的培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，NH4+是必需的，或是一種較好的無(wú)機(jī)氮；另一方面，黃麻的胚則絕對(duì)需要硝態(tài)氮。據(jù)Umbeck和Norstog(1979)報(bào)道，培282.碳水化合物和培養(yǎng)基的滲透壓蔗糖被認(rèn)為是最好的碳源。蔗糖的作用有二：①提供能源②調(diào)節(jié)滲透壓，對(duì)未成熟胚的培養(yǎng)這個(gè)作用更重要。成熟胚在含2％蔗糖的培養(yǎng)基中就能長(zhǎng)得很好，但幼齡胚則要求較高水平的碳水化合物。適于原胚的蔗糖濃度一般為8％－12％，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，必須轉(zhuǎn)移到蔗糖水平逐步降低的培養(yǎng)基中。2.碳水化合物和培養(yǎng)基的滲透壓蔗糖被認(rèn)為是最好的碳源。29

Raghavan和Torrey認(rèn)為，胚在離體條件下的生長(zhǎng)和分化在很大程度上并不依賴于滲透壓的大小，而主要取決于某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的存在與否。高滲透壓阻止離體未成熟胚早熟萌發(fā)的作用可以用ABA有效地取代。高滲透壓的這種有利影響是否是通過(guò)它對(duì)內(nèi)源激素庫(kù)的作用而表現(xiàn)出來(lái)的，還有待今后的實(shí)驗(yàn)予以說(shuō)明。Raghavan和Torrey認(rèn)為，胚在離體條件下的30

在培養(yǎng)基中加入氨基酸，無(wú)論是單一的還是復(fù)合的，都能刺激胚的生長(zhǎng)。單一氨基酸以谷氨酰胺（Gln）最好，天冬酰胺（Asn）對(duì)促進(jìn)胚的生長(zhǎng)也很有效。3.氨基酸和維生素在培養(yǎng)基中加入氨基酸，無(wú)論是單一的還是復(fù)合的，都能刺31

復(fù)合氨基酸的作用好于單一氨基酸，可能是氨基酸之間存在著一種協(xié)同作用。復(fù)合氨基酸中一水解酪蛋白（CH）最好，但胚對(duì)CH濃度的敏感程度因物種而異，如毛曼陀羅和曼陀羅的胚在400mg/LCH培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的最好，50mg/LCH能促進(jìn)紫花曼陀羅胚的生長(zhǎng)，但100mg/L時(shí)則有毒害作用。復(fù)合氨基酸的作用好于單一氨基酸，可能是氨基酸之間存在32

雖然各種維生素一直被用于胚培養(yǎng)中，但它們的存在并非總是必要的。在有些情況下，維生素甚至可能對(duì)形態(tài)發(fā)生過(guò)程表現(xiàn)抑制作用。因而，最好是只有在通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了它們的必要性之后，再在培養(yǎng)基中加入維生素。雖然各種維生素一直被用于胚培養(yǎng)中，但它們的存在并非總33椰子汁（CM）4.天然的植物浸提物VanOverbeek等（1942）發(fā)現(xiàn)，在一種含有1％葡萄糖、1%瓊脂、無(wú)機(jī)鹽、甘氨酸、硫胺素、抗壞血酸、煙酸、維生素B6、腺嘌呤、琥珀酸和泛酸的培養(yǎng)基上，曼陀羅魚(yú)雷形期以后的胚能形成正常的幼苗。但心形胚和更幼齡的胚則不能發(fā)育。椰子汁（CM）4.天然的植物浸提物VanOver34

鑒于未成熟胚在胚珠中是被胚乳包圍著的，VanOverbeek等（1942)在上述培養(yǎng)基中添加了不經(jīng)高壓滅菌的椰子汁（CM，椰子的液體胚乳），以期培養(yǎng)更幼齡的胚。在這種改良培養(yǎng)基上，這些作者得以由小至150-200μm長(zhǎng)（心形期）和幼至授粉后10d的胚獲得了正常的幼苗。鑒于未成熟胚在胚珠中是被胚乳包圍著的，VanOve35

在椰子汁中存在的這些促進(jìn)生長(zhǎng)的因子被稱為“胚因子”?！芭咭蜃印钡陌l(fā)現(xiàn)是胚培養(yǎng)史上的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，此后在若干物種中幼胚培養(yǎng)都獲得了成功。在椰子汁中存在的這些促進(jìn)生長(zhǎng)的因子被稱為“胚因子”36為了找到一種適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)以能取代椰子汁進(jìn)行紫花曼陀羅心形期以前幼胚(G150pm長(zhǎng)）的培養(yǎng)，Matsubara(1962）曾試驗(yàn)過(guò)很多種天然物質(zhì)，其中包括水解酪蛋白、干酵母、銀杏胚乳和若干種被子植物種子得到的浸提物，其中羽扇豆幼齡種子和佛手瓜成熟種子的酒精浸提物與椰子汁效果相同。為了找到一種適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)以能取代椰子汁進(jìn)行紫花曼陀羅心形期以前37Kent和Brink(1947)報(bào)道，海棗和香蕉浸提物、小麥面筋水解物、牛奶、番茄汁，能夠促進(jìn)大麥未成熟胚的生長(zhǎng)和抑制它們的早熟萌發(fā)。Kent和Brink(1947)報(bào)道，海棗和香蕉浸提物、38

為了由胚和胚段誘導(dǎo)愈傷組織，通常都需在培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素，或二者都加。然而，除了在某些植物中為了打破休眠以外，沒(méi)有證據(jù)表明離體的成熟的或未成熟的胚的正常發(fā)育需要生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。實(shí)際上，生長(zhǎng)素對(duì)于胚的生長(zhǎng)通常表現(xiàn)抑制作用。5.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)為了由胚和胚段誘導(dǎo)愈傷組織，通常都需在培養(yǎng)基中加入生39

Monnier(1978)建議，在胚培養(yǎng)基中不應(yīng)加人植物激素，以免引起結(jié)構(gòu)異常。他認(rèn)為胚對(duì)大多數(shù)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)都是自主的。在這點(diǎn)上至少對(duì)GA3來(lái)說(shuō)已在菜豆上得到了清楚的證明，其中胚柄可以滿足離體胚對(duì)激素的需要。Monnier(1978)建議，在胚培養(yǎng)基中不應(yīng)加人406.培養(yǎng)基的pH

不同植物胚或胚的不同發(fā)育階段對(duì)pH要求不同。如紫花曼陀羅心形早期的胚培養(yǎng)最適pH值為5.0—7.5，薺菜的胚培養(yǎng)最適pH值為5.4—7.5。6.培養(yǎng)基的pH不同植物胚或胚的不同發(fā)育階段對(duì)pH417.培養(yǎng)條件溫度：多數(shù)在25-30℃之間生長(zhǎng)良好。光：一般認(rèn)為光對(duì)于胚的生長(zhǎng)不很重要。7.培養(yǎng)條件溫度：多數(shù)在25-30℃之間生長(zhǎng)良好。429.2.1胚柄在胚培養(yǎng)中的作用

胚柄是一個(gè)短命的結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)在原胚的胚根一端，一般是當(dāng)胚達(dá)到球形期時(shí)胚柄發(fā)育到最大限度。有的研究表明胚柄積極參與幼胚的發(fā)育過(guò)程。

9.2胚柄在胚培養(yǎng)中的作用和胚的早熟萌發(fā)9.2.1胚柄在胚培養(yǎng)中的作用胚柄是一個(gè)短命的結(jié)構(gòu)43

較老的胚無(wú)論有無(wú)完整的胚柄在培養(yǎng)中都能正常的生長(zhǎng)，幼胚若去掉胚柄就會(huì)顯著降低形成小植株的頻率。胚柄在胚培養(yǎng)中的作用：①產(chǎn)生生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，特別是GA3。②去掉胚柄會(huì)引起胚的損傷。較老的胚無(wú)論有無(wú)完整的胚柄在培養(yǎng)中都能正常的生長(zhǎng)，幼44

由于胚柄既小又易受損傷，很難把它與胚一起剝離出來(lái)，因而在一般情況下培養(yǎng)的胚都不具完整的胚柄。然而有些研究指出，在培養(yǎng)中胚柄的存在對(duì)于幼胚的存活是個(gè)關(guān)鍵因素。由于胚柄既小又易受損傷，很難把它與胚一起剝離出來(lái)，因45

Cionini等（1976)看到，在紅花菜豆中．雖然較老的胚(500pm或更長(zhǎng)）無(wú)論有無(wú)完整的胚柄在培養(yǎng)中都能正常生長(zhǎng)，然而在幼胚培養(yǎng)中，去掉胚柄就會(huì)顯著降低形成小植株的頻率。

Yeung和Sussex(1979)指出，和無(wú)胚柄的胚培養(yǎng)相比，若胚柄完整地連在胚上，或雖與胚分離但在培養(yǎng)基上與胚緊緊相靠，則會(huì)顯著刺激胚的進(jìn)一步發(fā)育。Cionini等（1976)看到，在紅花菜豆中．雖然46

按照這些作者的看法．胚柄促進(jìn)生長(zhǎng)的活性在胚的心形早期達(dá)到高潮。在所試驗(yàn)過(guò)的各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)中，濃度為5mg/L的赤霉素最能有效地取代胚柄的作用。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與Alpi等（1975)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Alpi指出，在紅花菜豆中，心形期時(shí)胚柄中赤霉素的活性比胚本身中約高30倍。子葉形成之后，胚柄開(kāi)始解體，其中赤霉素的水平急劇下降，但在胚本身中赤霉素的水平增高。按照這些作者的看法．胚柄促進(jìn)生長(zhǎng)的活性在胚的心形早期479.2.2胚的早熟萌發(fā)胚的發(fā)育過(guò)程：分裂和分化期：細(xì)胞分裂但很少生長(zhǎng)；分化各種主要組織。生長(zhǎng)期：細(xì)胞體積迅速增大并分裂成熟期：很少發(fā)生或不發(fā)生細(xì)胞分裂或體積增大，合成并貯存各種貯藏休眠期：發(fā)育停滯萌發(fā)期：細(xì)胞體積重新增大并發(fā)生分裂；胚生長(zhǎng)

在胚培養(yǎng)或發(fā)育過(guò)程中未經(jīng)完成正常的胚胎發(fā)育過(guò)程而形成幼苗的現(xiàn)象叫做早熟萌發(fā)。9.2.2胚的早熟萌發(fā)胚的發(fā)育過(guò)程：在胚培養(yǎng)或發(fā)育48

離體的未成熟胚在培養(yǎng)基上不僅能越過(guò)休眠期，而且還常常終止進(jìn)行此后的胚胎途徑的發(fā)育，它們并不表現(xiàn)晚期胚胎發(fā)生過(guò)程所特有的正常生物合成活性，相反的它們長(zhǎng)成幼小的幼苗，而且這些幼苗只具有那些當(dāng)胚離體時(shí)已具有的結(jié)構(gòu)。在胚培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)抑制早熟萌發(fā)。離體的未成熟胚在培養(yǎng)基上不僅能越過(guò)休眠期，而且還常常49抑制早熟萌發(fā)的外界因子①高滲透壓：培養(yǎng)基中加入CH；或培養(yǎng)基中高濃度的蔗糖（12％—18％）②低氧壓③高溫④高光強(qiáng)⑤脫落酸GA3可誘發(fā)某些植物未成熟胚的早熟萌發(fā)。抑制早熟萌發(fā)的外界因子①高滲透壓：培養(yǎng)基中加入CH；或培養(yǎng)基50

目的是克服受精后障礙，獲得有萌發(fā)能力的雜種胚。方式有三種：①雜種幼胚在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)②雜種幼胚的胚乳看護(hù)培養(yǎng)③雜種幼胚的愈傷組織培養(yǎng)9.3通過(guò)“胚拯救”獲得遠(yuǎn)緣雜種目的是克服受精后障礙，獲得有萌發(fā)能力的雜種胚。方51雜種幼胚在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)

把雜種胚在開(kāi)始夭折之前剝離出來(lái)，置于一種適當(dāng)?shù)娜斯づ囵B(yǎng)基上培養(yǎng)，則雜種胚表現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)潛力，最終長(zhǎng)成雜種植株。雜種幼胚在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)把雜種胚在開(kāi)始夭折之前剝離52雜種幼胚的胚乳看護(hù)培養(yǎng)

如果胚的夭折發(fā)生在發(fā)育的極早期，人工培養(yǎng)基很難取代天然胚乳的作用，采用第一種方法拯救雜種仍會(huì)遇到很大困難，在這種情況下，則可以嘗試胚乳的看護(hù)培養(yǎng)。雜種幼胚的胚乳看護(hù)培養(yǎng)如果胚的夭折發(fā)生在發(fā)育的極早期53雜種幼胚的愈傷組織培養(yǎng)

在以上兩種方法皆難湊效的情況下，則可嘗試雜種幼胚愈傷組織培養(yǎng)法，即先把雜種幼胚誘導(dǎo)成愈傷組織，經(jīng)過(guò)或短或長(zhǎng)的繼代培養(yǎng)之后，再誘導(dǎo)雜種愈傷組織分化植株。雜種幼胚的愈傷組織培養(yǎng)在以上兩種方法皆難湊效的情況下54雜種幼胚愈傷組織培養(yǎng)獲得雜種植株的程序：

1.有性雜交

2.雜種幼胚培養(yǎng)

3.雜種愈傷組織形成和繼代

4.愈傷組織增殖與莖芽分化

5.愈傷組織繼續(xù)邊增殖邊分化，再生植株邊增殖邊壯苗

6.雜種愈傷組織細(xì)胞染色體加倍

7.雜種試管苗染色體加倍

8.煉苗和移栽

9.再生植株雜種幼胚愈傷組織培養(yǎng)獲得雜種植株的程序：

1.有性雜交

2.559.4胚分化不全的種子在培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生

胚分化不全的種子:在很多顯花植物（屬于19個(gè)科）中，在植株上已發(fā)育充分的種子其胚內(nèi)并無(wú)胚根、胚芽和子葉的分化。9.4胚分化不全的種子在培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生胚分化不全56

在菟葵（毛茛科）中，種子在脫落時(shí)所含的胚為梨形，只包含幾百個(gè)細(xì)胞，有一個(gè)長(zhǎng)的胚柄。待種子落到地面之后，胚通過(guò)種子內(nèi)生長(zhǎng)，最后才具備了一個(gè)成熟的雙子葉植物胚的一般形態(tài)。在菟葵（毛茛科）中，種子在脫落時(shí)所含的胚為梨形，只包含57

在蘭花以及在列當(dāng)科的若干根寄生成員中，種子中的胚也是尚未分化的；但在這些植物中，胚不能發(fā)生種子內(nèi)生長(zhǎng)現(xiàn)象，球形胚不經(jīng)進(jìn)一步胚胎分化即直接形成幼苗。

在這類植物的胚中，靠近珠孔的一端稱做“胚根極”，背離珠孔的一端稱做“胚芽極”。在蘭花和這些列當(dāng)科植物中，胚的兩極中都只有一極參與種苗的發(fā)育。在蘭花以及在列當(dāng)科的若干根寄生成員中，種子中的胚也是58

在蘭花種子萌發(fā)期間，胚的胚芽極增大，形成一個(gè)類似小球體的結(jié)構(gòu)，稱做原球莖。起初原球莖不含葉綠素，以后逐漸轉(zhuǎn)綠。達(dá)到一定大小之后，原球莖分化出根和莖。在蘭花中整個(gè)幼苗就是以這種方式，只是通過(guò)胚的胚芽極的分裂而形成的。在各種蘭花的種子培養(yǎng)中，幼苗發(fā)育的方式幾乎全是這樣。在蘭花種子萌發(fā)期間，胚的胚芽極增大，形成一個(gè)類似小球59

與蘭花不同，在屬于列當(dāng)科的根寄生植物中，幼苗一般只是通過(guò)胚的胚根極的活動(dòng)形成的。

Kadry等研究發(fā)現(xiàn)，在列當(dāng)科植物Orobanchecrenata中，種子萌發(fā)時(shí)胚的胚根極形成一個(gè)“胚根柱”，其頂端能穿入寄主的根。留在寄主根外的那部分胚根柱進(jìn)行增殖，形成一團(tuán)不規(guī)則的組織，稱做小塊莖，從中分化出莖。與蘭花不同，在屬于列當(dāng)科的根寄生植物中，幼苗一般只是60

但Kumar等指出，若改變培養(yǎng)基成分，這類寄生植物幼苗發(fā)育的方式可由單極性變?yōu)殡p極性。在補(bǔ)加CM或酵母浸出物的TB培養(yǎng)基上，萌發(fā)是單極性的（幼苗只是由胚根極的活動(dòng)形成的）。在TB培養(yǎng)基中，若加入IAA(0.1mg/L)，激動(dòng)素(0.5-10mg/L)，GA3(5-30mg/I.)或Strigol(0.01μg/L)，幼苗發(fā)育的方式即變?yōu)殡p極性的：胚芽極分化成一個(gè)莖芽，胚根極長(zhǎng)出根。但Kumar等指出，若改變培養(yǎng)基成分，這類寄生植物幼61

在TB培養(yǎng)基中，若以葡萄糖、甘露糖或棉子糖取代蔗糖，也會(huì)促進(jìn)雙極性萌發(fā)。在補(bǔ)加GA3(7.5mg/L）的TB培養(yǎng)基上雙極性幼苗發(fā)育方式的頻率最高。在TB培養(yǎng)基中，若以葡萄糖、甘露糖或棉子糖取代蔗糖，62

菟絲子屬（Cuscuta）植物的成熟胚具有一個(gè)明顯的胚芽，但沒(méi)有胚根。無(wú)論是在冤絲子的胚胎發(fā)生過(guò)程中還是在成熟胚中，都不存在原表皮層、根分生組織或下胚軸。當(dāng)種子在活體中萌發(fā)時(shí)，由胚芽形成一個(gè)莖，但胚的胚根端在萌發(fā)開(kāi)始后4-5d逐漸死掉。因此在這種植物中完全沒(méi)有根系。

菟絲子屬（Cuscuta）植物的成熟胚具有一個(gè)明顯63Truscott(1966)在菟絲子成熟胚和未成熟胚的培養(yǎng)中，為了試驗(yàn)?zāi)芊袢斯ふT發(fā)生根，曾在培養(yǎng)基中加人了各種生長(zhǎng)物質(zhì)，如腺嘌呤、激動(dòng)素和GA3，或復(fù)合營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如CM或CH，然而，所有這些處理沒(méi)有一個(gè)能誘發(fā)生根。Truscott由此斷定，菟絲子不具生根潛力。Truscott(1966)在菟絲子成熟胚和未成熟胚的培養(yǎng)中64

Swamy報(bào)道蘭屬植物的合子休眠期為2個(gè)月。但也有人報(bào)道，蘭屬合子的休眠期為30天。

蘭科植物的胚只保持在球形胚階段而不再進(jìn)一步發(fā)育。球形胚的大小及細(xì)胞數(shù)目，則因種類不同而異。如天麻的球形胚，僅有十幾個(gè)細(xì)胞，而建蘭的球形胚有幾十個(gè)細(xì)胞。這些細(xì)胞中，都貯藏了豐富的脂滴。蘭花胚發(fā)育特點(diǎn)：Swamy報(bào)道蘭屬植物的合子休眠期為2個(gè)月。但也有人65

蘭屬植物的胚乳不發(fā)育，但有些種胚柄發(fā)達(dá)。在墨蘭胚的發(fā)育中觀察到有3-8條胚柄。這些胚柄是單細(xì)胞的，長(zhǎng)度可與胚體的長(zhǎng)度相等。當(dāng)種子成熟時(shí)，胚柄已消失。蘭屬植物的胚乳不發(fā)育，但有些種胚柄發(fā)達(dá)。在墨蘭胚的發(fā)66

蘭屬植物的種子數(shù)量很大，個(gè)體很小。一枚蘭花果實(shí)中的種子數(shù)量從1300-4000000粒之多。種子的長(zhǎng)度從0.25-1.2mm。種子的形狀多樣化，有橢圓形、紡錘形、圓球形等等。種皮有薄有厚，有的種皮透明，有的則呈深棕色。種子內(nèi)含有豐富的貯藏物。蘭屬中許多種的種子呈兩頭稍尖的細(xì)長(zhǎng)的紡錘形、種子內(nèi)含有32％的脂肪，1％的糖。蘭屬植物的種子數(shù)量很大，個(gè)體很小。一枚蘭花果實(shí)中的種67蘭科植物中的附生種，其種子一般容易萌發(fā)，而地生種則較困難。生長(zhǎng)在熱帶地區(qū)的附生種，種子萌發(fā)率高，萌發(fā)所需時(shí)間短；而生長(zhǎng)在溫帶地的地生種，如春蘭、蕙蘭等則自然的萌發(fā)率極低，萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)半年或9個(gè)月之久，成為所謂萌發(fā)困難的種。蘭科植物中的附生種，其種子一般容易萌發(fā)，而地生種則較68造成萌發(fā)困難的原因，可能是多方面的：（l）種子的小胚分化不完全；（2）沒(méi)有胚乳，缺乏萌發(fā)時(shí)所需要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源；（3）種皮的透水性差，不易吸水膨脹，促使胚中的酶分解；（4）種皮里可能存在某些抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)。造成萌發(fā)困難的原因，可能是多方面的：（l）種子的小胚分化不完69

由于自然萌發(fā)的頻率極低，所以雜交所得到的種子還需要進(jìn)行人工培養(yǎng)，才能獲得幼苗。由于自然萌發(fā)的頻率極低，所以雜交所得到的種子還需要進(jìn)行70

生長(zhǎng)習(xí)性不同的附生蘭和地生蘭的種子在無(wú)菌培養(yǎng)后，萌發(fā)過(guò)程中的形態(tài)發(fā)生也存在著差異。

附生種的種子萌發(fā)初始，都形成白色的圓球形的原球莖。隨著原球莖體積的增大，其上出現(xiàn)毛狀假根，繼而原球體轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，但原球莖不伸長(zhǎng)，在原球莖頂端出現(xiàn)芽。整個(gè)外觀與荸薺頗為相似。頂端的芽，長(zhǎng)大分化出莖和葉。生長(zhǎng)習(xí)性不同的附生蘭和地生蘭的種子在無(wú)菌培養(yǎng)后，萌發(fā)71

地生種的種子萌發(fā)時(shí)，種子中的胚突破種皮后，開(kāi)始白色圓球形，但很快就伸長(zhǎng)，成為長(zhǎng)柱形，是為地下莖或根狀莖。在根狀莖表面有間隔地長(zhǎng)出一叢叢毛狀假根。根狀莖的頂芽分化出芽、轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可長(zhǎng)成幼苗。地生種的種子萌發(fā)時(shí)，種子中的胚突破種皮后，開(kāi)始白色72溫暖春暖花開(kāi)溫暖春暖花開(kāi)73媽媽的囑托蝴蝶的愛(ài)情媽媽的囑托蝴蝶的愛(ài)情74恭喜發(fā)財(cái)純潔的愛(ài)恭喜發(fā)財(cái)純潔的愛(ài)75蝴蝶蘭的胚培養(yǎng)技術(shù)及其快速繁殖研究

王慧瑜,張曉申,楊錄軍等蝴蝶蘭屬熱帶氣生蘭，多產(chǎn)于熱帶亞洲，其株型美觀、色彩艷麗、花期持久，在熱帶蘭中有“蘭花皇后”之美稱，是蘭科植物中栽培最廣泛、最普及的種類之一，它屬單莖性氣生蘭，植株極少發(fā)育側(cè)枝，常規(guī)情況下種子發(fā)育不完全，極難萌發(fā)。因此世界上多采用組織培養(yǎng)來(lái)繁殖種苗。胚培養(yǎng)技術(shù)比較簡(jiǎn)單，為此我們對(duì)蝴蝶蘭胚培養(yǎng)技術(shù)和快速繁殖進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為我國(guó)的蝴蝶蘭的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供參考。蝴蝶蘭的胚培養(yǎng)技術(shù)及其快速繁殖研究

王慧瑜,張曉申,楊錄761材料與方法1.1材料

3個(gè)蝴蝶蘭雜交品種。即紅花1號(hào),粉紅1號(hào),條紋1號(hào)。1.2方法1.2.1外植體消毒將蝴蝶蘭雜交種的果莢，以70%的酒精表面消毒15s后置于10%次氯酸鈉溶液中消毒15min，再用0.1%的氯化汞消毒5min，再用無(wú)菌水沖洗5～6次。1材料與方法1.1材料3個(gè)蝴772.2接種超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌手術(shù)刀將果莢前后兩端各切去一部分以不露出胚為好。然后用手術(shù)刀把中間部分切開(kāi)，用無(wú)菌鑷子夾出其中的胚，浸入小半瓶無(wú)菌水中，使之?dāng)U散均勻。最后用吸管將胚帶水吸出接種在培養(yǎng)基上。每瓶胚量不能太多。2.2接種782.3培養(yǎng)條件培養(yǎng)基采用1/2MS,VW，改良KC和改良N6,進(jìn)行播種胚培養(yǎng)試驗(yàn)。培養(yǎng)溫度25℃～28℃,每日光照10h～12h，光照強(qiáng)度1600lx～2000lx。2.3培養(yǎng)條件792.1胚在不同培養(yǎng)基上發(fā)芽、生長(zhǎng)情況分別以1/2MS，VW，改良KC和改良N6為培養(yǎng)基，加入5%香蕉汁，將紅花1號(hào)，粉紅1號(hào)，條紋1號(hào)金黃色胚無(wú)菌播種后，進(jìn)行觀察，從表可以看出，在4種培養(yǎng)基上胚生長(zhǎng)情況不一樣，在改良KC培養(yǎng)基中胚的萌發(fā)情況和成苗率都最好。無(wú)菌播種一周后，胚由金黃色轉(zhuǎn)為淡黃色。這是由于胚吸水膨脹，撐破種皮形成淡黃色胚，然后胚由淡黃色轉(zhuǎn)為綠色，2個(gè)月后形成第一個(gè)芽鞘。2.1胚在不同培養(yǎng)基上發(fā)芽、生長(zhǎng)情況80園藝植物組織培養(yǎng)第9章ppt課件812.2不同成熟度種子胚對(duì)發(fā)芽的影響在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),莢果內(nèi)種子胚的顏色為乳白色和淡白色，播種后發(fā)芽率為30％左右,并且生長(zhǎng)也很慢，部分胚自然變黑、老化死亡。果莢內(nèi)種子胚顏色為乳黃色和淡黃色的，播種后發(fā)芽率在50％左右，生長(zhǎng)較慢，部分胚變黑、老化死亡。果莢內(nèi)種子胚顏色為金黃色時(shí)，播種后發(fā)芽率在85%以上，生長(zhǎng)較快，成苗率也較高?？梢?jiàn)，莢果的成熟度對(duì)種子胚播種后的發(fā)芽成苗有很大影響。2.2不同成熟度種子胚對(duì)發(fā)芽的影響822.3小苗的轉(zhuǎn)接和移栽把胚培養(yǎng)的小苗轉(zhuǎn)接2～3次，就可以長(zhǎng)到4cm高，具有3～4片葉的出瓶苗。轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基以改良KC，附加香蕉汁15%，活性炭0.4%，蔗糖3%，試管苗生長(zhǎng)良好。試管苗移栽以3～5月份內(nèi)為好，將試管苗取出，用自來(lái)水清洗其根部的培養(yǎng)基，將根部放于70%甲基托布津藥液中消毒4h(小時(shí))，藥液濃度為1500倍，晾干后放于背蔭處準(zhǔn)備定植。2.3小苗的轉(zhuǎn)接和移栽83定植材料為水苔，定植后半個(gè)月，每?jī)芍苁┓室淮巍９芾硪笫牵簻囟?8℃～28℃，前兩周濕度80%～90%為宜，后漸漸保持在70%左右。蝴蝶蘭對(duì)光的要求是1500～2000lx，采用加蓋2層60%的遮陽(yáng)網(wǎng)為好，移栽后2年內(nèi)可以開(kāi)花。定植材料為水苔，定植后半個(gè)月，每?jī)芍苁┓室淮?。管理?49.5胚愈傷組織的形態(tài)發(fā)生潛力

和由成熟器官如葉片、莖或根所產(chǎn)生的愈傷組織相比，已知胚愈傷組織具有高度的再生能力，特別是在禾谷類植物中，這種差別非常明顯。Dale和Deambrogio(1979）培養(yǎng)了大麥的頂端分生組織、中胚軸、葉鞘、未成熟胚和成熟胚，其中由根和胚做外植體產(chǎn)生的愈傷組織長(zhǎng)得最好，但只有未成熟胚愈傷組織能進(jìn)行莖的分化。9.5胚愈傷組織的形態(tài)發(fā)生潛力和由成熟器官如葉85蔡體樹(shù)等（1989)曾對(duì)34種基因型的小麥未成熟胚對(duì)離體培養(yǎng)的反應(yīng)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，94％的供試基因型愈傷組織誘導(dǎo)頻率都可達(dá)到80％以上，不同基因型幼胚愈傷組織誘導(dǎo)頻率之間不存在顯著差異。然而，愈傷組織分化頻率則因基因型的不同而不同，變動(dòng)在0～60％之間，平均為32.70％，此外，他們的研究還表明，雖然最適于培養(yǎng)的未成熟胚的大小為1mm左右，但小至0.3mm的未成熟胚仍能以幾乎100％的頻率形成愈傷組織，60％左右的愈傷組織能分化出再生植株，只是所需的時(shí)間比1mm左右的胚較長(zhǎng)。

蔡體樹(shù)等（1989)曾對(duì)34種基因型的小麥未成熟胚對(duì)86枇杷幼胚培養(yǎng)與體胚誘導(dǎo)植株再生

沈慶斌，賴鐘雄，蔡漢權(quán)等1材料與方法1．1供試材料“解放鐘”與“長(zhǎng)紅3號(hào)”采自福建農(nóng)林大學(xué)果樹(shù)園，“早鐘”采自福建省農(nóng)科院“國(guó)家枇杷種質(zhì)資源保持圃”。枇杷幼胚培養(yǎng)與體胚誘導(dǎo)植株再生

沈慶斌，賴鐘雄，蔡漢權(quán)等1871．2幼胚培養(yǎng)于2003年1月26日取枇杷成年結(jié)果樹(shù)上的幼果，此時(shí)“解放鐘”與“長(zhǎng)紅3號(hào)”的幼胚發(fā)育階段介于魚(yú)雷形胚與子葉形胚初期之間，長(zhǎng)1～5mm；“早鐘”處于子葉形胚初期階段。長(zhǎng)3～7mm，經(jīng)常規(guī)方法消毒后，挑取幼胚作為外植體，操作時(shí)避免對(duì)幼胚的損傷?；九囵B(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為20g／L，瓊脂濃度為7g／L，pH5．8，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)(25±1)℃。1．2幼胚培養(yǎng)88影響枇杷幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)因素有AgNO3與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：設(shè)置了6種培養(yǎng)基(M1～M6)，比較AgNO3與2,4-D對(duì)枇杷幼胚培養(yǎng)的影響。每瓶接3個(gè)幼胚，每種培養(yǎng)基接30個(gè)，重復(fù)2次。M1～M6培養(yǎng)基成分如下：Ml：MS+2,4-D2；M2：MS+2,4-D1；M3:MS+2,4-D1+KT0.5；M4：MS+2,4-D1+KT0.5+AgNO35；M5：MS+2,4-D1+BA0.5；M6：MS+2,4-D2+BA0.1+AgNO35。(AgNO3與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度單位為mg／L)影響枇杷幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)因素有AgNO3與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)891．3枇杷胚性愈傷組織篩選對(duì)所誘導(dǎo)的各種不同類型愈傷組織進(jìn)行篩選，剔除生長(zhǎng)勢(shì)弱、褐變嚴(yán)重的愈傷組織，繼代保持生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、無(wú)褐變的愈傷組織，并對(duì)該類型愈傷組織進(jìn)行初步胚性檢測(cè)。1．3枇杷胚性愈傷組織