線蟲培養(yǎng)和繁殖

線蟲生長培養(yǎng)基（NematodeGrowthMedium，NGM）的配制1）稱取蛋白胨（peptone）2.5g，瓊脂20g，NaCl3g，置于潔凈2000mL玻璃三角瓶，加入蒸餾水975ml，120℃高壓蒸汽滅菌30min，之后置于552）依次加入5mg/ml膽固醇（乙醇溶解，不滅菌）1ml，高壓滅菌的1MMgSO4，1MCaCl2，1MKPO4緩沖液（pH6.0）各1ml，搖勻即可。1MKPO4緩沖液的配置方法為：稱取108.3gKH2PO4和35.6gK2HPO4，溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值到6.0即可。1.3倒板1）倒平板在無菌條件下進(jìn)行，應(yīng)保證倒入每個無菌培養(yǎng)皿（直徑6cm）的培養(yǎng)基量基本一致，否則平板的厚薄相差太大將會影響觀察。也可以用移液器分裝8-9ml到每一個培養(yǎng)皿中，保證每個平板厚度基本一致。2）將倒好的平板在室溫下放置1~2天，一方面可以檢驗(yàn)是否有污染，一方面讓水汽晾干，之后可倒置于4℃1.3菌液測試菌液測試：因?yàn)镺P50菌株是無抗性的，所以在大批量鋪菌前需進(jìn)行菌液測試的。1）將擴(kuò)增好的OP50菌液搖勻，用移液器吸取約20uL至NGM平板中，用三角玻棒推開，每瓶菌液測試4-6個平板。2）將鋪好的平板倒置，于37℃3）如果確認(rèn)無污染后，在超凈臺中將菌液分裝到無菌離心管中，約15mL/管，4℃4）若測試板上長出大量雜菌（菌落突起，色澤亮麗），需重新?lián)u菌。1.4鋪菌可以用兩種方法給NGM平布鋪菌：涂板法和滴板法。涂板法:將菌液倒入無菌一次性培養(yǎng)皿（直徑6cm）中，用三角玻棒蘸取菌液，鋪在平板上，蘸一次鋪一個。鋪10個培養(yǎng)皿，三角玻棒須蘸上酒精灼燒一次，防止污染培養(yǎng)皿里的母液。注意三角玻棒不樣碰到培養(yǎng)皿的內(nèi)壁，整個過程無菌操作。滴板法：準(zhǔn)備高壓滅菌后的無菌玻璃吸管，在酒精燈上來回移動灼燒后稍晾涼，從分裝的菌液中直接吸取菌液，懸空滴在NGM平板的中央，可滴1-3滴，這種方法可以避免使用三角玻棒接觸培養(yǎng)基，污染的概率比較小，缺點(diǎn)是這樣得到的菌苔邊緣非常厚。2線蟲的繁殖2.1在NGM平板間轉(zhuǎn)移線蟲的方法線蟲周身透明，可以通過有透視光源的解剖鏡進(jìn)行觀察。通常用到的目鏡是10倍，物鏡1-5倍多檔。也就是說總共放大10-50倍。三種方法可用于NGM平板間的線蟲轉(zhuǎn)移，第一種非?？焖偾曳奖?，簡稱為“chunking”，也即切塊法。當(dāng)平板上的OP50被吃光后，用無菌解剖刀切下一小塊瓊脂（指甲蓋大小即可）放入新NGM平板上。通常每個小塊上有幾百條線蟲。解剖刀需要提前消毒，通常蘸取75%乙醇，在酒精燈上過火，灼燒片刻即可。這種辦法廣泛用于饑餓平板上的線蟲轉(zhuǎn)移，尤其當(dāng)線蟲鉆入瓊脂內(nèi)，無法挑取時(shí)。切塊法主要用于純合品系線蟲的轉(zhuǎn)移，如果是雜合子或者需要通過雜交保存的品系最好不要使用此方法。第二種方法用滅菌濾紙條轉(zhuǎn)移法，將滅菌濾紙條（通常寬度1厘米，長度5厘米）放到饑餓的平板上，當(dāng)濾紙吸收了水分并粘附了許多線蟲后，輕輕的用濾紙條接觸新的平板，實(shí)現(xiàn)線蟲的轉(zhuǎn)移。同樣的第三種方法是用挑蟲器（wormpicker）挑取單只或多只線蟲轉(zhuǎn)移到新的平板中。Picker是由鉑金絲和玻璃管組成，鉑金絲的一端通過灼燒連接到玻璃管上，另一端壓平呈鏟狀。在解剖鏡下找到目標(biāo)線蟲后，用picker末端在線蟲的附近壓瓊脂培養(yǎng)基，使線蟲爬到picker上再轉(zhuǎn)移到新的平板中；或者用picker末端蘸取少量OP50，輕輕地而且快速的碰觸線蟲的上部，線蟲被picker上的菌液粘住。往新的平板放線蟲時(shí)，注意要慢慢降低picker末端，輕輕接觸瓊脂平面或菌苔邊緣等線蟲爬出來，不要將瓊脂戳破，否則線蟲喜歡鉆入瓊脂中，這樣在做雌雄雜交需要統(tǒng)計(jì)后代表型時(shí)，被統(tǒng)計(jì)的群體數(shù)會大大減少。Picker上的鉑金絲升降溫非?？?，對任何培養(yǎng)皿進(jìn)行操作的前后都應(yīng)該將pick的鉑金絲過火滅菌。轉(zhuǎn)移線蟲時(shí)，注意開關(guān)蓋子要操作迅速，而且蓋子要趴著放在旁邊。每個線蟲培養(yǎng)皿都需要標(biāo)記品系名（甚至是詳細(xì)的基因型）以及日期，字跡清晰以免混淆各個品系。記住要標(biāo)記在有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，不要標(biāo)記在蓋子上。廢棄的平板統(tǒng)一放入有蓋的垃圾桶里。2.2線蟲轉(zhuǎn)移頻率的確定轉(zhuǎn)移線蟲的頻率由培養(yǎng)線蟲的基因型，溫度以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定。雜合子或者雜交群體最好每兩代轉(zhuǎn)移一次，而且在OP50被食用光前轉(zhuǎn)移操作起來比較簡單。如果需要從饑餓平板中轉(zhuǎn)移單只線蟲時(shí)，可以先通過切塊法讓線蟲爬出來，再挑取目標(biāo)線蟲。如果需要得到有各個發(fā)育階段的線蟲群體，可以每一天都轉(zhuǎn)移一次線蟲，連續(xù)4天基本即可得到包含全部發(fā)育階段的線蟲群體。25℃的培養(yǎng)的線蟲將食物吃光需要的時(shí)間比15℃培養(yǎng)的要長一倍，所以溫度決定了你的轉(zhuǎn)移頻率。另外為了防止平板蒸干，可以用parafilm將平板密封保存2.3線蟲的培養(yǎng)溫度線蟲在16℃-25℃之間生長良好，不過更通用的培養(yǎng)溫度是20℃。已有的研究表明25℃下線蟲的生長速度比16℃快2.1倍。20℃下線蟲的生長速度比16℃快1.3倍。培養(yǎng)線蟲時(shí)要根據(jù)線蟲品系的要求在合適的溫度培養(yǎng)。因?yàn)橛械木€蟲品系只能在16℃3.處理污染的線蟲線蟲在培養(yǎng)過程中，有可能被霉菌，酵母，粘菌污染，雖然這些污染對線蟲沒有什么傷害，但是對干凈的線蟲進(jìn)行性狀統(tǒng)計(jì)和轉(zhuǎn)移遠(yuǎn)比對污染的線蟲進(jìn)行相同的操作要容易得多，所以要及時(shí)處理污染線蟲。3.1霉菌的清理如果NGM平板中的霉菌很小，而且只有少量菌絲，沒有孢子時(shí)，可以用消毒解剖刀切掉霉菌，以阻止其繼續(xù)繁殖。但是很多時(shí)候，當(dāng)你發(fā)現(xiàn)霉菌時(shí)，霉菌菌絲擴(kuò)散范圍比較大，而且孢子也形成了，并飛散到平板各個位置。這時(shí)可以通過切塊-轉(zhuǎn)移法清理線蟲上攜帶的霉菌孢子。具體操作步驟如下：1）將解剖刀置于火焰上消毒，切取霉菌污染平板的瓊脂一小塊，記住打開和關(guān)上已污染平板的蓋子要迅速。2）將小塊轉(zhuǎn)移到新平板的瓊脂上，記住不要放在菌苔上。等待線蟲從小塊上爬進(jìn)菌苔中，在爬行中，線蟲體表的霉菌孢子被OP50粘走了。3）一旦線蟲到達(dá)小塊對面的菌苔邊緣，用picker挑取線蟲到新的平板中即可。3.1粘菌和酵母的清理粘菌和酵母的清理主要通過裂解法完成，次氯酸鈉裂解液能裂解線蟲蟲體，但不損傷有卵殼保護(hù)的卵。裂解液由5M氫氧化鈉溶液和0.5%次氯酸鈉溶液按1：2的體積比混合即可，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。4.線蟲的凍存與復(fù)蘇4.1線蟲的凍存線蟲可以在液氮中永久保存，這為線蟲廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究提供了方便。線蟲凍存成功與否取決于三個因素；用于凍存的線蟲處于合適的發(fā)育階段；凍存液中甘油的比例合適；在-80℃與非饑餓狀態(tài)的線蟲（成蟲，dauer）以及卵相比，剛剛處于饑餓狀態(tài)的小幼蟲（L1-L2時(shí)期）在凍存后仍有較好的存活率。因此一般選剛剛處于饑餓狀態(tài)（OP50菌苔已被吃光）、且有比較多L1-L2線蟲的平板用于凍存。當(dāng)凍存液中甘油的終濃度為15%時(shí)，即可保證比較好的存活率。在凍存過程中必須保證以每分鐘下降一度的速度降溫直至-80℃。首先將含有凍存線蟲的凍存管置于泡沫聚乙烯盒子（盒子中有插入凍存管的空腔），然后將盒子置于-80℃冰箱中，12凍存中需要兩中溶液S緩沖液以及含有30%甘油（體積比）的S緩沖液。S緩沖液配方：0.05MK2HPO4129ml，0.05MKH2PO4871ml，NaCl5