第二章蛋白質(zhì)樣品的制備課件

第二章蛋白質(zhì)樣品的制備第二章蛋白質(zhì)樣品的制備1

蛋白質(zhì)樣品的制備是蛋白質(zhì)組研究的第一步，無論后續(xù)采用怎樣的分離或鑒定手段，樣品制備都是關(guān)鍵步驟。從蛋白質(zhì)組大規(guī)模研究的角度而言，要求樣品制備盡可能獲得所有的蛋白質(zhì)，但是由于蛋白質(zhì)種類多、豐度不一和物化特性多樣等，要達(dá)到真正的全息制備是具有難度的。蛋白質(zhì)樣品的制備是蛋白質(zhì)組研究的第一步，無2“在制備中丟失的蛋白是永遠(yuǎn)不可能在后面的試驗(yàn)中彌補(bǔ)回來的”“在制備中丟失的蛋白是永遠(yuǎn)不可能在后面的3樣品制備的原則盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失。細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑以防止蛋白的降解。樣品裂解液應(yīng)該新鮮配置，并且分裝凍存于-80℃。勿反復(fù)凍融已制備好的樣品。通過超速離心清除所有的雜質(zhì)。加入尿素后加溫不要超過37℃，防止氨甲?；揎椀鞍?。樣品制備的原則盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失4一、樣品的類型

1.整體樣品是生物個(gè)體小的物種（如微生物），可以整體取樣。

2.組織樣品有一個(gè)采樣的過程，就是從整體部分或整批器官中抽取一定量具有代表性的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞樣品包括固體基質(zhì)中培養(yǎng)的細(xì)胞、體外懸浮培養(yǎng)生長的細(xì)胞、周期性細(xì)胞樣品（如紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）和從組織中分離同類的細(xì)胞樣品。4.可溶性樣品是可溶性液體樣品，如血清、血漿、尿樣、腦脊液以及細(xì)胞和組織的水溶性提取物。第一節(jié)樣品破碎與分離蛋白質(zhì)一、樣品的類型第一節(jié)樣品破碎與分離蛋白質(zhì)5二、組織與細(xì)胞破碎為了完全分析所有的細(xì)胞內(nèi)蛋白，組織與細(xì)胞必須進(jìn)行有效的破碎。破碎方法的選擇依賴于樣品來源（如細(xì)胞、固體組織或者其它的生物材料），同時(shí)也依賴于這種分析是獲得所有的蛋白質(zhì)還是特殊的亞細(xì)胞器組分。蛋白酶在細(xì)胞破碎時(shí)很可能釋放出來，其會(huì)導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)降解而使雙向電泳圖譜的分析復(fù)雜化，因此蛋白質(zhì)樣品應(yīng)該利用蛋白酶抑制劑加以保護(hù)。

二、組織與細(xì)胞破碎6（一）溫和的裂解方法

通常應(yīng)用于組分比較簡(jiǎn)單的樣品，例如組織培養(yǎng)的細(xì)胞、血細(xì)胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的細(xì)胞器，例如只需要裂解胞質(zhì)蛋白、完整的線粒體或其它的細(xì)胞器。有時(shí)這些技術(shù)聯(lián)合起來應(yīng)用。（一）溫和的裂解方法71.滲透裂解

非常溫和的裂解方法，可進(jìn)一步進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí)應(yīng)用對(duì)象：血細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞。

操作步驟：將細(xì)胞懸浮于滲透胞溶液中，細(xì)胞溶脹而釋放出細(xì)胞內(nèi)容物。

1.滲透裂解82.凍融裂解

許多類型的細(xì)胞可以通過快速反復(fù)凍融得到裂解應(yīng)用對(duì)象：細(xì)菌細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞。

操作步驟：使用液氮，快速反復(fù)凍融至符合實(shí)驗(yàn)要求為止。

2.凍融裂解93.裂解液裂解

含有去污劑的裂解液處理細(xì)胞、組織以裂解細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來。應(yīng)用對(duì)象：組織培養(yǎng)細(xì)胞

操作步驟：將細(xì)胞直接置裂解液或樣品液中，進(jìn)行懸浮處理。3.裂解液裂解104.酶裂解

有細(xì)胞壁的細(xì)胞可以通過酶解去除細(xì)胞壁得以溫和裂解。應(yīng)用對(duì)象：植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞。操作步驟：將細(xì)胞懸浮于專一性酶的等滲溶液中。

4.酶裂解11二、劇烈的蛋白裂解

常用于難于破碎的細(xì)胞，如固體組織內(nèi)的細(xì)胞，或具有堅(jiān)硬細(xì)胞壁的細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，這種方法可以使細(xì)胞完全破碎裂解。二、劇烈的蛋白裂解121.超聲裂解法

超聲儀可以產(chǎn)生超聲波，通過切應(yīng)力來裂解細(xì)胞。在劇烈攪拌的狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生剪切效果。

應(yīng)用對(duì)象：懸浮細(xì)胞

操作步驟：要進(jìn)行間歇處理，減輕產(chǎn)生熱和泡沫，樣品處理應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。1.超聲裂解法132.壓力杯法

在高壓下迫使細(xì)胞穿過小孔徑而產(chǎn)生剪切力，從而裂解細(xì)胞。

應(yīng)用對(duì)象：微生物細(xì)胞，如細(xì)菌、霉菌、酵母細(xì)胞及含有細(xì)胞壁的細(xì)胞。

操作步驟：將細(xì)胞懸浮液置于預(yù)冷的壓力杯中，施加壓力，然后收集擠出液。2.壓力杯法143.研磨法

用研缽或研杵研磨細(xì)胞

應(yīng)用對(duì)象：固體組織細(xì)胞、微生物細(xì)胞。

操作步驟：組織或細(xì)胞通常凍存于液氮中，隨后研磨成粉狀，加氧化鋁或砂有助于研磨。3.研磨法154.機(jī)械勻漿法

使用勻漿器破碎細(xì)胞或組織應(yīng)用對(duì)象：固體組織，如心臟、肝臟、腎臟組織和細(xì)胞懸液。操作步驟：先盡量將組織剪成塊，然后加有蛋白酶抑制劑的冷勻漿液進(jìn)行勻漿，過濾或離心收集。4.機(jī)械勻漿法165.玻璃珠勻漿法

劇烈震蕩的玻璃珠打破細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞內(nèi)容物

應(yīng)用對(duì)象：細(xì)胞懸液或微生物操作步驟：用等體積的預(yù)冷裂解液重懸細(xì)胞，置于結(jié)實(shí)的管子里。每克細(xì)胞（濕重）加入1-3克玻璃珠，劇烈震蕩1min，冰浴1min。重復(fù)上述步驟。5.玻璃珠勻漿法17三、用蛋白酶抑制劑防止蛋白裂解

當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞裂解時(shí)，蛋白酶會(huì)釋放出來，這會(huì)嚴(yán)重影響電泳的結(jié)果，因此需要采取一些策略。如果可能的話，直接加入強(qiáng)變性劑。蛋白酶在低溫下無活性，因此盡可能在低溫下進(jìn)行樣品制備。另外，許多組織蛋白酶在PH超過9.0的時(shí)候會(huì)失活，因此在樣品裂解液中出現(xiàn)Tris、碳酸鈉和載體兩性電解質(zhì)時(shí)也可以抑制蛋白降解。雖然這些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持降解蛋白的活性。此時(shí)，需要應(yīng)用蛋白酶抑制劑。三、用蛋白酶抑制劑防止蛋白裂解18⑴PMSF(苯甲基磺酰氟）

是一種不可逆抑制劑，通常濃度為1mmol/L,滅活絲氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，現(xiàn)用現(xiàn)加效果較好；另外，在二硫蘇糖醇（DTT）或者β-巰基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能會(huì)減小，因此在含巰基的試劑中可在晚些時(shí)候加入。⑵

AEBSF

為不可逆抑制劑，通常工作濃度為4mmol/L，作用與PMSF相似，但溶解性較好，且毒性低。但是AEBSF可能會(huì)改變蛋白的等電點(diǎn)。⑴PMSF(苯甲基磺酰氟）19⑶金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙（EDTA）乙二醇雙四乙酸（EGTA）

通常應(yīng)用1mmol/L的工作濃度，通過螯合自由的金屬離子來抑制金屬蛋白酶活性。⑷肽蛋白酶抑制劑

亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制劑，在含DTT的溶液中以低濃度的形式保持活性，抑制一些絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制劑A（pepstatinA），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin），抑制許多絲氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，這些蛋白酶抑制劑價(jià)格昂貴，而且它們是小肽片段，可能會(huì)出現(xiàn)在二維電泳圖譜中，其中胃蛋白酶抑制劑A在PH=9的時(shí)候不能抑制蛋白酶。⑶金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙（EDTA）20⑸甲苯磺酰賴氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）

通常濃度在0.1-0.15mmol/L，這些相同的成分不可逆抑制許多絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。⑹Benzamidine

通常濃度為1-2mmol/L，抑制絲氨酸蛋白酶。⑺變性劑在低溫條件下處理。①直接加入強(qiáng)變性劑8mol/L脲、10％TCA或2％SDS。②強(qiáng)堿下抑制酶活，許多組織蛋白酶在pH超過9.0的時(shí)候失活。⑸甲苯磺酰賴氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺酰21四、蛋白質(zhì)沉淀步驟

這是一種可選擇的方法。通常用于選擇性清除雜質(zhì)，如鹽離子、核酸、脂類等會(huì)干擾二維電泳結(jié)果。重懸之后的沉淀蛋白也可用來制備濃度稀釋的樣品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后并不容易重懸。因此在樣品的制備過程中，應(yīng)用沉淀的步驟可能會(huì)改變蛋白的二維電泳圖譜。四、蛋白質(zhì)沉淀步驟22⑴硫酸銨沉淀（鹽析）

原理：在高鹽溶液中，蛋白傾向于聚合，并從溶液中沉淀下來。許多潛在的雜質(zhì)（如核酸）將保持在溶液中。步驟：蛋白濃度大于lmg/ml，緩沖液濃度大于50mmol/L,并含有EDTA,緩慢加入硫酸銨至飽和，攪拌10-30min，通過離心沉淀蛋白。

然而許多蛋白在高鹽溶液中是可溶的，因此，這種方法只能被用來預(yù)分離或富集蛋白。并且，殘存的硫酸銨會(huì)干擾IEF,必須被清除。

⑴硫酸銨沉淀（鹽析）23⑵TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）

這是一種有效的蛋白沉淀方法，將TCA加到提取液中，終濃度將高達(dá)10％-20％。蛋白質(zhì)可于冰上沉淀30min。另外，組織樣品可以直接用10％-20％的TCA進(jìn)行勻漿。這種方法可限制蛋白降解和其它的化學(xué)修飾。最后用丙酮或乙醇清洗沉淀，以除去TCA。

然而，蛋白質(zhì)再溶解是很困難的，并且不能完全再溶。殘留的TCA必須通過乙醇或丙酮徹底清除，若過多暴露與低PH溶液中可能導(dǎo)致某些蛋白降解或修飾。⑵TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）24⑶丙酮沉淀

這種有機(jī)溶劑通常用來沉淀蛋白，以清除許多雜質(zhì)，如去污劑、脂類。于提取物中加入至少3倍體積的冰丙酮，使蛋白在-20℃沉淀至少2h，再離心沉淀蛋白。殘留的丙酮通過空氣干燥或凍干除去。⑶丙酮沉淀25⑷在丙酮中用TCA沉淀

兩者聯(lián)合應(yīng)用更加有效，通常用10％TCA在丙酮中重懸裂解的樣品溶液（含有0.01％

β-巰基乙醇溶液或20mmol/LDTT）。至少在-20℃沉淀45min，通過離心沉淀蛋白，并用含0.01％β-巰基乙醇溶液或20mmol/LDTT

的冰丙酮清洗沉淀。通過空氣干燥或凍干去除殘留的丙酮。此方法仍然存在難再溶的現(xiàn)象。⑷在丙酮中用TCA沉淀26⑸用苯酚提取，隨后在甲醇中用醋酸銨沉淀

這對(duì)于雜質(zhì)含量高的植物樣品很有效。蛋白質(zhì)被提取到飽和酚中，然后在甲醇中用醋酸銨從酚相中沉淀蛋白。這些沉淀在甲醇中用醋酸銨洗滌幾次，然后用丙酮清洗，殘留的丙酮通過蒸發(fā)除去。但是這種方法比較復(fù)雜，并且耗時(shí)較多。⑸用苯酚提取，隨后在甲醇中用醋酸銨沉淀27在蛋白質(zhì)樣品制備中，蛋白質(zhì)裂解是指對(duì)樣品蛋白質(zhì)進(jìn)行增溶性溶解的過程，其目的是破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)之間的共價(jià)與非共價(jià)相互作用；使蛋白質(zhì)變性及還原；去除非蛋白質(zhì)組分，如核酸、脂類等。為了達(dá)到這一目的，在蛋白質(zhì)樣品制備過程中需使用表面活性劑、還原劑及離液劑。第二節(jié)蛋白質(zhì)裂解技術(shù)在蛋白質(zhì)樣品制備中，蛋白質(zhì)裂解是指對(duì)樣品蛋28一、裂解液

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)裂解是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)間的分開與疏遠(yuǎn)程度關(guān)系到雙向電泳的分離效果。選擇適宜的裂解劑能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)間的良好分離，是提高雙向電泳分離效果的一個(gè)有力措施。⑴離液劑

尿素是常用的離液劑，它的主要作用是改變或破壞氫鍵等次級(jí)鍵的結(jié)構(gòu)，使得蛋白變性并使蛋白酶失活。尿素作為一種中性的離液劑，通常在裂解液中的濃度為8mol/L。尿素可溶解和解折疊大多數(shù)的蛋白質(zhì)，形成完全隨機(jī)的構(gòu)象，使所有的離子基團(tuán)暴露于溶液中。近來硫脲的加入可以進(jìn)一步提高溶解度，特別是膜蛋白。在實(shí)際應(yīng)用中，需要高溶解強(qiáng)度時(shí)，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素聯(lián)合使用。一、裂解液

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)裂解是一個(gè)重29⑵還原劑

還原劑主要是用來斷裂蛋白分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白的溶解性。通常用的還原劑有β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或二硫赤蘚糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前常用的是DTT。⑵還原劑30⑶去污劑

去污劑主要是通過破壞蛋白之間的疏水相互作用，以確保蛋白完全溶解和防止通過疏水相互作用導(dǎo)致蛋白聚合。去污劑有離子型、非離子型和兼性離子型等幾類。經(jīng)常使用的有陰離子去污劑SDS，非離子去污劑NP-40和TritonX-100，兩性離子去污劑CHAPS。原則上去污劑應(yīng)該是非離子型或者是兼性離子型，這樣才不會(huì)影響蛋白質(zhì)的遷移位置。最初，兩個(gè)相似的非離子去污劑NP-40和TritonX-100被廣泛應(yīng)用。隨后研究表明：兼性離子去污劑CHAPS的效果更好。⑶去污劑31二、裂解技術(shù)⑴裂解液的組成⑵裂解策略二、裂解技術(shù)32

通?？梢杂眉?xì)胞或組織中的全蛋白組分進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析，也可以進(jìn)行樣品的分級(jí)、即采用各種方法將細(xì)胞或組織中的全蛋白分成幾部分，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究。樣品預(yù)分級(jí)的主要方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性和蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞器定位進(jìn)行分級(jí)，如專門分離出細(xì)胞核、核糖體、細(xì)菌細(xì)胞壁、葉綠體、線粒體等的蛋白質(zhì)成分。樣品預(yù)分級(jí)不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)，還可以針對(duì)某一細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析。第三節(jié)樣品預(yù)分級(jí)通?？梢杂眉?xì)胞或組織中的全蛋白組分進(jìn)行蛋33一、亞細(xì)胞器的分離

主要是利用細(xì)胞內(nèi)各種顆粒大小、形狀和密度不同，在不同離心力場(chǎng)下進(jìn)行差速離心或在不同密度下進(jìn)行密度梯度離心，從而獲得不同亞細(xì)胞器組分。㈠細(xì)胞勻漿取待分析的組織細(xì)胞樣品以0.9％NaCl溶液反復(fù)清洗，加入SE緩沖液（0.25mol/L蔗糖、1mmol/LEDTA)，在低溫下研磨成勻漿備用。

一、亞細(xì)胞器的分離34㈡亞細(xì)胞器的差速離心及密度梯度離心分離1.差速離心指在密度均一的介質(zhì)中不同大小的顆粒通過在不同離心力場(chǎng)的作用下沉降而分離。2.密度梯度離心指用一定的介質(zhì)在離心管中形成連續(xù)或不連續(xù)的梯度，將細(xì)胞混懸液置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層分離。⑴速度沉降分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器，其原理是生物顆粒在密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降。⑵等密度沉降平衡適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大的離心力和足夠長時(shí)間沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)中，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。㈡亞細(xì)胞器的差速離心及密度梯度離心分離35二、細(xì)胞的分離二、細(xì)胞的分離36三、分步裂解提取1.目的與原理

由于蛋白質(zhì)在細(xì)胞中存在部位不同，而不同蛋白質(zhì)的溶解性亦不相同，為了提高雙向電泳的分離效果，有時(shí)需要采取分步提取的方法來盡可能的提取更多的蛋白質(zhì)。分步提取法現(xiàn)已被用于提取各種不同組織的蛋白質(zhì)，其中通常采用以水相、有機(jī)相和表面活性劑為基礎(chǔ)的提取溶液。但是，仍然很難提取到樣品的全部蛋白質(zhì)組和低豐度蛋白質(zhì)。此外，一些疏水蛋白質(zhì)，包括膜蛋白和膜相關(guān)蛋白，以及高度抗性組織（如頭發(fā)和皮膚組織）的蛋白質(zhì)幾乎很難進(jìn)行雙向電泳分離，特別是在應(yīng)用固相pH梯度的等電聚焦中有待進(jìn)一步的研究。三、分步裂解提取1.目的與原理372.方法

Molley等(1998)首先提出了順序抽提法，其步驟是和高效裂解緩沖液結(jié)合起來。具體步驟如下：⑴水溶液的提取

約5-15mg細(xì)胞中加入2ml裂解液Ⅰ（40mmol/LTris）。反復(fù)凍融3-4個(gè)循環(huán)，加入適量的DNaseⅠ和RNaseA，震蕩混勻。離心收集上清液，冷凍干燥器中抽干后即為第一步提取物。⑵含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取向第一步的沉淀中加入500ul的裂解液Ⅱ（8mol/L的Urea，4％CHAPS，100mmol/LDTT,40mmol/LTris，0.5％Pharmalyte3-10，20ug/mlDNaseⅠ和5ug/mlRNaseA）劇烈震蕩混勻，離心收集上清即為第二步提取物。2.方法38⑶含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取將上一步所余的沉淀用40mmol/LTris清洗后，加入200ul裂解液Ⅲ（5mol/LUrea，2mol/Lthiourea，2％CHAPS，2％SB3-10，2mmol/LTBP,40mmol/LTris,0.5％Pharmalyte3-10,20ug/mlDNaseⅠ和5ug/mlRNaseA)劇烈震蕩混勻，離心后收集上清，保存于-70℃⑶含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取39分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐漸增加的。第一步裂解液只含有40mmol/LTris，其余為去離子水，只溶解偏親水性的蛋白。第二步裂解液屬傳統(tǒng)的裂解方法，含有表面活性劑CHAPS、還原劑DTT、解聚劑Urea等成分，由于具有良好的溶解能力，可以溶解親水性、中性和較疏水性的蛋白、第三步裂解液中添加了能夠促進(jìn)疏水蛋白質(zhì)溶解的成分，如表面活性劑SB3-10、還原劑DTT、解聚劑thiourea，主要溶解偏疏水性的蛋白。分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐漸增加的。40⑴細(xì)胞器蛋白質(zhì)的提?、颇さ鞍椎奶崛∨c分離⑶核蛋白的提取與分離三、特殊蛋白質(zhì)的提?、偶?xì)胞器蛋白質(zhì)的提取三、特殊蛋白質(zhì)的提取41第四節(jié)樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定第四節(jié)樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定42樣品中的非蛋白的不純物質(zhì)可能干擾蛋白的分離及二維電泳圖譜的質(zhì)量，因此，在樣品制備中需考慮清除這些雜質(zhì)。⑴鹽離子、痕量緩沖液和其它帶電荷的小分子

鹽離子會(huì)干擾電泳過程，應(yīng)盡可能保持低濃度或加以清除。通常用透析、旋轉(zhuǎn)透析、凝膠過濾和沉淀/懸浮的方法進(jìn)行脫鹽處理。第五節(jié)清除影響電泳的圖譜的雜質(zhì)

樣品中的非蛋白的不純物質(zhì)可能干擾蛋白的分離第五節(jié)43⑵內(nèi)源性小分子（如核酸、代謝物和磷脂）

這些物質(zhì)通常帶負(fù)電荷，能發(fā)生偏陽極側(cè)的聚焦不全。通常用TCA/丙酮沉淀除去這些物質(zhì)。⑶離子去污劑

離子去污劑，如SDS，通常用于蛋白的提取和溶解，但卻強(qiáng)烈干擾IEF。SDS與多肽形成復(fù)合物。如果SDS不被除去，則不能正確聚焦。通常用含有兼性離子去污劑或非離子去污劑的重泡脹溶液稀釋含SDS的樣品。通過丙酮沉淀也可以去除部分SDS。⑵內(nèi)源性小分子（如核酸、代謝物和磷脂）44⑷核酸（RNA、DNA）

核酸增加樣品的黏度，并導(dǎo)致背景彌散；高分子質(zhì)量的核酸能夠阻滯凝膠孔徑；核酸可能通過電穩(wěn)態(tài)相互作用與蛋白結(jié)合，從而阻礙聚焦；如果分離的蛋白通過銀染檢測(cè)，凝膠的核酸也將染色，導(dǎo)致高背景。通?？捎肈Nase/RNaseA混合物處理樣品中的核酸，將其變?yōu)閱位蚬押塑账?。常?.1倍體積的含有1mg/mlDNase、0.25mg/mlRNaseA的溶液和50mmol/LMgCl2溶液在冰上孵育。然而DNase/RNaseA也可能出現(xiàn)在電泳圖中。超離可以除去大分子核酸，然而，也會(huì)除去高分子量蛋白。但應(yīng)用低離子強(qiáng)度的提取液時(shí)，帶負(fù)電的核酸很可能與帶正電的蛋白形成復(fù)合物。高離子強(qiáng)度或高PH提取可最大減少這些相互作用（注意：提取時(shí)所加的鹽離子必須在后續(xù)的步驟中除去）。⑷核酸（RNA、DNA）45⑸多糖

多糖能阻礙凝膠孔徑，或?qū)е鲁恋?，或延長聚焦時(shí)間，或出現(xiàn)水平條文。某些多糖含有負(fù)電荷，能與蛋白形成復(fù)合物。通常用硫酸銨或苯酚/醋酸銨沉淀的方法，隨后離心。超速離心也可除去高分子多糖。⑸多糖46⑹脂類

許多蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白，可以與脂類形成復(fù)合物，這會(huì)降低其溶解性，影響其等電點(diǎn)和分子量。脂類也能與去污劑形成復(fù)合物，減低其效率。通常用強(qiáng)變性劑和去污劑最大程度減少蛋白與脂類的相互作用，但可能需大量的去污劑。⑹脂類47⑺酚類組分

苯酚通常在許多植物組織中出現(xiàn)，通過酶催化的氧化反應(yīng)來修飾蛋白。通常在組織提取過程中應(yīng)用還原劑防止苯酚的氧化。⑻不溶物質(zhì)

在樣品中的不溶物質(zhì)會(huì)阻礙凝膠孔徑，并且導(dǎo)致聚焦不良。通常在IEF前，應(yīng)除去所有的不溶物質(zhì)⑺酚類組分48TheEndTheEnd49例題7.何謂蛋白質(zhì)組，簡(jiǎn)述其研究特點(diǎn)。（中國科學(xué)院2003試題）知識(shí)要點(diǎn)（1）蛋白質(zhì)組—由全套基因編碼控制的蛋白質(zhì)。（2）蛋白質(zhì)組的研究特點(diǎn)：是對(duì)細(xì)胞不同時(shí)期蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究，主要表現(xiàn)為多樣性、無限性、動(dòng)態(tài)性、時(shí)空性和相互作用性。解題思路根據(jù)知識(shí)要點(diǎn)可以對(duì)本題進(jìn)行解答，但除去解答要點(diǎn)以外，要對(duì)知識(shí)點(diǎn)盡量擴(kuò)展，并將答案逐條列出，做到條理清晰，內(nèi)容詳盡。參考答案（1）蛋白質(zhì)組（proteome）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）和基因組（genome）兩個(gè)詞的雜合，意思指由一個(gè)基因組（genome）一種生物或一個(gè)細(xì)胞、組織所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)（protein），即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。（2）其研究特點(diǎn)是：①由于蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，因此，對(duì)于不同類型的細(xì)胞或同一個(gè)細(xì)胞在不同的活動(dòng)狀態(tài)下，蛋白質(zhì)組的構(gòu)成是不一樣的。②對(duì)于基因組而言，要測(cè)定的基因組不論大小，其核苷酸的數(shù)量是明確的。然而，對(duì)于蛋白質(zhì)組來說，蛋白質(zhì)的種類究竟有多少就很難說了。③一個(gè)個(gè)體的基因組自個(gè)體誕生到死亡，始終是不變的。而作為新陳代謝的主要執(zhí)行者的蛋白質(zhì)組，在個(gè)體的生命活動(dòng)中卻總是變動(dòng)不停的。④DNA通常位于細(xì)胞核內(nèi)，且保持穩(wěn)定，因此測(cè)定基因組的DNA序列是不受時(shí)空的影響。而在蛋白質(zhì)組的研究中，不僅要考慮時(shí)間的因素，更要考慮空間的影響。⑤某一個(gè)蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)，通常是離不開它與其它蛋白質(zhì)之間的相互作用。例題7.何謂蛋白質(zhì)組，簡(jiǎn)述其研究特點(diǎn)。（中國科學(xué)院200350與本章內(nèi)容出現(xiàn)過的部分考題1.下列哪種方法是由于細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成導(dǎo)致細(xì)胞破碎的（）A.真空干燥B.酶解法C.凍融法D.滲透壓法2.當(dāng)向蛋白質(zhì)純?nèi)芤褐屑尤胫行喳}時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度（

）A．增大B.減小C.先增大，后減小D.先減小，后增大3.鹽析法與有機(jī)溶劑沉淀法比較，其優(yōu)點(diǎn)是（

）A.分辨率高B.變性作用小C.雜質(zhì)易除D.沉淀易分離4.β巰基乙醇為強(qiáng)烈的蛋白變性劑。（）5.蛋白質(zhì)的翻譯后修飾主要包括

。

A乙?；疊糖基化C磷酸化D上述各種修飾6.TritonX-100是一種：()ACa螯合劑B蛋白酶抑制劑C去垢劑D脫氫酶抑制劑與本章內(nèi)容出現(xiàn)過的部分考題1.下列哪種方法是由于細(xì)胞內(nèi)冰晶的5116、人類基因組估計(jì)有3萬個(gè)基因，但因?yàn)?/p>

，這些基因可編碼約10萬種蛋白質(zhì)。（中山大學(xué)2009試題）13、目前實(shí)驗(yàn)室最常用的鹽析試劑是（NH4）2SO4,理由是

。（中山大學(xué)2009試題）27、尿素是一種蛋白質(zhì)變性劑,其主要作用是____破壞蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)_______其作用機(jī)制為______與多肽主鏈競(jìng)爭(zhēng)氫鍵_____（復(fù)旦2000）31.測(cè)定蛋白質(zhì)紫外吸收的波長,一般在_______,主要由于蛋白質(zhì)中,存在著____,_____,_____殘基側(cè)鏈基團(tuán)（上海交通大學(xué)2000）1、.用下列方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量時(shí)，哪一種方法需要完整的肽鍵（

）（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2002試題）A凱氏定氮法B紫外吸收法C茚三酮反應(yīng)D雙縮脲法47、哪一種蛋白質(zhì)組分在280nm處，具有較大的光吸收？（B）（中國海洋大學(xué)2007）A色氨酸吲哚基B酪氨酸苯酚基C苯丙氨酸苯環(huán)D半胱氨酸的巰基E肽鏈中的肽鍵29、蛋白質(zhì)在280nm波長處有特征吸收峰，最大貢獻(xiàn)的氨基酸殘基是哪一種：（）（廈門大學(xué)2006試題）（A）精氨酸（B）組氨酸（C）苯丙氨酸（D）色氨酸第二章蛋白質(zhì)樣品的制備ppt課件5228.今有A，B，C，D四種蛋白質(zhì)，其分子體積由大到小的順序是A>B>C>D,在凝膠過濾柱層析過程中，最先洗脫出來的蛋白質(zhì)一般應(yīng)該是（）。（華東理工大學(xué)2008試題）

A.

AB.BC.CD.D32.鹽析法可使蛋白質(zhì)沉淀，但不引起變性，所以鹽析法常用于蛋白質(zhì)的分離純化（）。（中國海洋大學(xué)2007試題）33.尿素是蛋白質(zhì)的變性劑，高濃度尿素可拆開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵（）。（中山大學(xué)2003試題）35.有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)時(shí),介電常數(shù)的增加使離子間的靜電作用的減弱而致（）。（復(fù)旦大學(xué)2000試題）16.利用鹽濃度的不同可以提高或降低蛋白質(zhì)的溶解度（）。（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2000試題）

12.去垢劑是一類既有親水部分又有疏水部分的分子（）。（中國科學(xué)院2006試題）8.某蛋白質(zhì)pI為7.5，在pH6.0的緩沖液中進(jìn)行自由界面電泳，其泳動(dòng)方向?yàn)椋ǎ?。（華東理工大學(xué)2008試題；華東理工大學(xué)2009試題）A原點(diǎn)不動(dòng)B向正極泳動(dòng)C向負(fù)極泳動(dòng)D向兩極分別泳動(dòng)28.今有A，B，C，D四種蛋白質(zhì)，其分子體積由大到小的順5317.蛋白質(zhì)溶液出現(xiàn)沉淀與蛋白質(zhì)變性存在必然的關(guān)系。（

）（中科院2005）47.凱氏定氮法的原理是什么？紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量的原理是什么？（中科院2009）44.什么是蛋白質(zhì)組？什么是蛋白質(zhì)組學(xué)？如何理解高等生物細(xì)胞中一個(gè)基因組可以產(chǎn)生多少個(gè)蛋白質(zhì)組？（武漢大學(xué)2007）45.什么叫蛋白質(zhì)組？什么叫蛋白質(zhì)組學(xué)？（協(xié)和醫(yī)科大2004）17.蛋白質(zhì)溶液出現(xiàn)沉淀與蛋白質(zhì)變性存在必然的關(guān)系。（54例題6.“一個(gè)基因一個(gè)蛋白”的說法對(duì)嗎？為什么？（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院2010試題）知識(shí)要點(diǎn)（1）基因（gene）是指產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所需要的全部核苷酸序列。（2）在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可以多種mRNA形式剪接。并且，同一蛋白可能以許多形式進(jìn)行翻譯后修飾，所以一個(gè)基因可能產(chǎn)生多個(gè)蛋白。（3）有些蛋白質(zhì)是由多種基因控制的，而且在不同發(fā)育階段，同一種蛋白質(zhì)也可能由不同的基因編碼。解題思路