免疫組織化學(xué)課件

免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)1掌握內(nèi)容免疫組化的基本原理免疫組化的基本過程免疫組化的染色技術(shù)分類常用的免疫組化的染色原理和方法注意事項掌握內(nèi)容免疫組化的基本原理2免疫組織化學(xué)的基本概念I(lǐng)mmunohistochemistry又稱免疫細胞化學(xué)。它是組織化學(xué)的分支，它是用免疫學(xué)原理（特異的抗原抗體反應(yīng)）來對組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進行原位檢測技術(shù)。免疫組織化學(xué)的基本概念31．發(fā)展簡史1941年Coons首先用熒光素標記抗體—檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功60年代Nakane建立酶標抗體技術(shù)70年代Stemberger改良上述技術(shù)，建立過氧化物酶—抗過氧化物酶（PAP）技術(shù)，使免疫細胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)用。1．發(fā)展簡史480年代Hsu等建立了抗生物素的（ABC）法之后，免疫金—銀染色法、半抗原標記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問世。90年代分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細胞化學(xué)分類方法迅速發(fā)展2000年各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組化技術(shù)成為當今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力工具。80年代Hsu等建立了抗生物素的（ABC）法之后，免疫5免疫組織化學(xué)的優(yōu)點1、特異性強——免疫組化從理論上講也是“一對一”的組織細胞中抗原的特定顯示2、敏感性高——抗體稀釋到幾千分之一、上萬分之一，甚至幾億分之一時仍可在組織細胞中與抗原結(jié)合3、定位準確，形態(tài)與功能相結(jié)合4.方法步驟統(tǒng)一——若掌握一種技術(shù)操作方法步驟，則一通百通。免疫組織化學(xué)的優(yōu)點1、特異性強——免疫組化從理論上講也是“一6免疫組織化學(xué)的基本原理應(yīng)用免疫學(xué)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及定量的研究免疫組織化學(xué)的基本原理應(yīng)用免疫學(xué)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，7基本過程抗原提取制備抗體抗體標記制備樣品免疫前樣品處理免疫反應(yīng)顯色反應(yīng)觀察分析基本過程抗原提取8一、提取抗原（antigen，Ag）生物化學(xué)各種方法提取抗原一類能刺激機體免疫系統(tǒng)使之產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體或抗原受體)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?；咎匦裕阂皇钦T導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是反應(yīng)原性一、提取抗原（antigen，Ag）9抗原（antigen，Ag）表位，抗原結(jié)合位點，抗原決定簇（epitope）Ag1234抗原（antigen，Ag）表位，抗原結(jié)合位點，抗原決定簇10表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體11抗體蛋白分為V區(qū)和C區(qū)，V區(qū)高度可變，是識別抗原的區(qū)域，C區(qū)是很保守的抗體蛋白分為V區(qū)和C區(qū)，12二、制備抗體即多克隆抗體（PcAb）單克隆抗體（McAb）和基因工程抗體二、制備抗體13整體水平抗體生成技術(shù)細胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達技術(shù)抗體的制備和選擇原則：種屬差異越大越好整體水平抗體生成技術(shù)細胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技14抗體的儲存新制備或購進的是原液或凍干品，抗血清為全血清，單克隆抗體是培養(yǎng)上清液或腹水。1、4℃保存（6個月）2、低溫保存（-70℃～-20℃，5年）3、真空干燥保存（5～10年）4、稀釋的抗體不能長時間保存，在4℃可存放1~3天，超過7天效價顯著降低?？贵w的儲存新制備或購進的是原液或凍干品，抗血清為15抗體的儲存注意：1、保存前需經(jīng)除菌2、保存液含防腐劑（濃度低時，應(yīng)加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保護劑；必要時需要加0.01-0.15％NaN3防腐劑以延長保存時間；酶標記抗體不能用NaN3，會抑制酶的活性）3、避免反復(fù)凍融，分裝（10ul或100ul/支）抗體的儲存注意：1、保存前需經(jīng)除菌16抗體稀釋的配制：

常用0.01mol/LpH7.4PBS或TBS緩沖液作抗體稀釋液。

抗體稀釋的配制：17

抗體的最佳稀度倍數(shù)：由于各種抗體的效價不同，組織中抗原強弱不一，應(yīng)根據(jù)不同情況作適當?shù)恼{(diào)整，以取得中等陽性稀釋度為佳，因其既適合于抗原性強和含量多的標本，也可用于抗原性弱的標本?？贵w的最佳稀度倍數(shù)：由于各種抗體的效價不同，組織中抗原強18三、抗體的標記物熒光素——異硫氰酸熒光素（FITC）、異硫氰酸羅達明(TRITC);德克薩斯紅；藻紅素等酶——堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等金屬：膠體金、膠體鐵、鐵蛋白等親和素、生物素、放射性同位素等三、抗體的標記物19四、樣品的制備組織材料處理是獲得良好免疫細胞組織化學(xué)分析的保障，必須保證要檢測的細胞或組織取材新鮮、固定即使及時、形態(tài)保存良好、抗原物質(zhì)的抗原性不被破壞。

標本的主要來源：活體組織、各種體液、穿刺液、培養(yǎng)細胞四、樣品的制備組織材料處理是獲得良好免疫細胞組織化20標本的固定與保存好的固定劑除能滿足一般組織學(xué)固定目的外，還需要：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物質(zhì)擴散（3）固定后的抗原能被抗體識別，不影響抗原抗體反應(yīng)標本的固定與保存好的固定劑除能滿足一般組織學(xué)固定目的21常用：10%福爾馬林（酸性）、乙醇、丙酮、甲醛、中性緩沖多聚甲醛、戊二醛混合固定液：Bouin液，Zamboni液、過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛（PLP）固定液常用：10%福爾馬林（酸性）、乙醇、丙酮、甲醛、中性緩沖多聚22固定方法細胞表面抗原——新鮮冰凍切片，后固定于丙酮單層細胞、病毒、細菌——冷丙酮、冷乙醇細胞懸液——先固定，然后離心制成標本可溶性抗原——甲醛蒸氣一般組織——新鮮取材、浸泡固定固定方法細胞表面抗原——新鮮冰凍切片，后固定于丙酮23切片方法冰凍切片石蠟切片：乙醇脫水時間要短；浸蠟要快，溫度低于60℃；玻片上要用黏附劑蠟塊盡快切片，密封保存在4℃；染色前徹底脫蠟一般為5μm蓋玻片、載玻片清洗干凈，載玻片要涂黏附劑：明膠硫酸鉻鉀法、多聚賴氨酸等切片方法冰凍切片24五、免疫反應(yīng)前的處理

1、抗原修復(fù)福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)，也導(dǎo)致了抗原決定簇被掩蓋。因此，抗原修復(fù)是影響免疫組化染色結(jié)果的基本因素

五、免疫反應(yīng)前的處理

1、抗原修復(fù)福爾馬林固定時，組織中的許25抗原修復(fù)(Antigenretrieval，AR)技術(shù)抗原修復(fù)是指切片免疫組織化學(xué)（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過程?？乖迯?fù)(Antigenretrieval，AR)技術(shù)抗26AR非加熱技術(shù)：蛋白酶消化或酸水解加熱技術(shù)：微波、水浴、高壓鍋AR非加熱技術(shù)：蛋白酶消化或酸水解27酶消化

(1)原理：

1)去除覆蓋于抗原決定簇表面的雜蛋白

2)斷交聯(lián)酶消化

(1)原理：

1)去除覆蓋于抗原決28胰蛋白酶：0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化鈣，用0.1NNaOH調(diào)pH至7.8。消化時間37℃30min。

主要用于細胞內(nèi)抗原的修復(fù)胰蛋白酶：0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化鈣，用029胃蛋白酶

0.4%胃蛋白酶，用0.1NHCI稀釋，消化時間37℃30～180min。主要用于細胞間抗原的消化。

此外還有蛋白酶K、鏈酶蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶等（細胞內(nèi)抗原修復(fù)）

工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1NHCI稀釋，消化時30修復(fù)方式：

①微波96℃±10min×2；

②直接加溫100℃，15min；

③水浴鍋100℃，15min；

④高壓鍋/消毒鍋120℃，5min；

⑤真空加熱10min；

修復(fù)方式：

①微波96℃±10min×2；

②直接加溫131修復(fù)介質(zhì)：

①0.01MpH6.0檸檬酸緩沖液(CB)；

②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);

③0.01MpH7.0PBS;

④2%硫酸鋁；⑤2％硝酸鋁；⑥生理鹽水；⑦蒸餾水。

修復(fù)介質(zhì)種類和溶液的摩爾濃度對修復(fù)效果影響較小，而pH值則影響較大。緩沖液以CB和Tris-HCL較常見。修復(fù)介質(zhì)：

①0.01MpH6.0檸檬酸緩沖液(CB)；32形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變：一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無明顯的破壞，而對細胞核內(nèi)影響較大，會出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染等現(xiàn)象。

熱處理后自然冷卻形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變：一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無明顯的破壞，而對細胞332、冰凍切片或細胞涂片的處理一般不需抗原修復(fù)一般脂質(zhì)細胞膜保存完整（除非用丙酮、乙醇固定）為了使抗體等大分子透過，需在膜上打缺口2、冰凍切片或細胞涂片的處理一般不需抗原修復(fù)34冰凍切片或細胞涂片的處理1、非離子型表面活性劑：TritonX-100等0.1%-0.5%，加入漂洗液或抗體稀釋液中使用2、將固定并粘附的載玻片通過上升乙醇到二甲苯，再下降乙醇到水3、反復(fù)凍融：蔗糖防凍處理，低溫-70℃速凍，室溫融化，反復(fù)2-3次。冰凍切片或細胞涂片的處理1、非離子型表面活性劑：Triton35免疫反應(yīng)前處理——3減少非特異性著色1、內(nèi)源性酶或生物素：用其特異性底物或親和物將其封閉；2、離子和電荷吸附：用特異性抗體來源的同種動物滅活非免疫血清，預(yù)處理。結(jié)合弱，不沖洗3、一抗的稀釋程度：預(yù)實驗4、沖洗程度：除了封閉血清不需要沖洗之外，其余每一步都需液沖洗3次～5次。常用PBS免疫反應(yīng)前處理——3減少非特異性著色1、內(nèi)源性酶或生物素：用36六、免疫組織化學(xué)的主要方法根據(jù)Ag—Ab結(jié)合方式分成：①直接法②間接法③多層法六、免疫組織化學(xué)的主要方法37直接法熒光素或酶等直接標記特異性抗體（一抗）上，標記抗體與抗原結(jié)合（在切片上）優(yōu)點：簡單，時間短，特異性強。

缺點：靈敏度低，所需抗體量大（不經(jīng)濟），每一種抗原都需制備其標記抗體應(yīng)用：基本不用了?。庖邿晒馊旧ǔ猓┲苯臃?8間接法

標記物標記在二抗上。顯色后鏡檢

特點：較直接法靈敏（一抗上至少可以結(jié)合兩個二抗）；帶標記的二抗，可定位多種抗原常用與免疫熒光、免疫金技術(shù)間接法

標記物標記在二抗上。顯色后鏡檢

特點：較39多層法多層法40按標記物的性質(zhì)分成①免疫熒光技術(shù)②免疫酶技術(shù)（酶標抗體法、橋法、PAD法、ABC法）③免疫金屬技術(shù)（免疫鐵蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）六、免疫組織化學(xué)的主要方法按標記物的性質(zhì)分成六、免疫組織化學(xué)的主要方法41

１.異硫氰酸熒光素FITC２.四乙基羅達明３.四甲基異硫氰酸羅達明４.藻紅蛋白

▲呈現(xiàn)不同的熒光：綠色熒光(FITC)

橙色熒光

橙紅色熒光

紅色熒光等

免疫熒光技術(shù)１.異硫氰酸熒光素FITC免疫熒光技術(shù)42免疫熒光組織化學(xué)染色方法

1.直接法：簡便、快速，用已知特異性標記熒光的一抗與組織細胞內(nèi)抗原結(jié)合。

操作流程：(1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干PBS洗；石蠟切片脫蠟至水，消化30min，PBS洗。免疫熒光組織化學(xué)染色方法

1.直接法：簡便、快速，用已知43(2)適當稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)37℃溫育1h，PBS洗3×3min。

(3)0.01%伊文氏藍襯染1～3min，PBS洗3×3min，蒸餾水洗2次，除去NaCl結(jié)晶。

(4)pH9.0甘油緩沖液（磷酸鹽）封片。（必須無自發(fā)熒光，無色透明）

(5)鏡檢(2)適當稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)37℃溫育1h44海馬細胞

微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)海馬細胞45

培養(yǎng)的成纖維細胞微管呈綠色核呈藍色培養(yǎng)的成纖維細胞462.間接法是直接的重要改進，先用特異性一抗與組織細胞內(nèi)抗原結(jié)合，隨后用熒光標記二抗與一抗特異性結(jié)合。2.間接法是直接的重要改進，先用特異性一抗與組織細胞內(nèi)抗47熒光雙標記技術(shù)應(yīng)用免疫熒光技術(shù)在同一張組織切片上同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分，即謂雙重或多重免疫標記。此理論同時也可應(yīng)用到其他免疫技術(shù)。如：免疫酶雙重標記；免疫膠體金標記。顯示的水平可以是光鏡，也可以是電鏡熒光雙標記技術(shù)應(yīng)用免疫熒光技術(shù)在同一張組織切片上同時或先后顯48

常用的熒光素配伍主要為：異硫氰酸熒光素(FITC)呈綠色與羅丹明(RB200)或異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）呈紅色。技術(shù)方法敏感、特異，需選用各自特定的激發(fā)濾光片分別觀察或二次曝光顯影，樣本不能長期保存。細胞結(jié)構(gòu)不清晰常用的熒光素配伍主要為：異硫氰酸熒光素(FITC)呈綠色與49免疫酶組化免疫學(xué)(抗原抗體反應(yīng))

酶細胞化學(xué)(底物顯色反應(yīng))+特異性敏感性定位性可視性免疫酶組化免疫學(xué)酶細胞化學(xué)+特異性敏感性50免疫酶技術(shù)基本原理：抗原＋［一抗］＋酶標記抗體或扛酶抗體通過酶與底物作用生成有色反應(yīng)物，定位組織或細胞內(nèi)抗原的一門技術(shù)。免疫酶技術(shù)基本原理：511、酶標抗體：酶分子與抗體分子共價結(jié)合，要求此種結(jié)合既不改變抗體的免疫反應(yīng)活性，也不影響酶的生物化學(xué)活性2、扛酶抗體：抗體與酶的結(jié)合為抗原抗體反應(yīng)，避免了共價結(jié)合，保護了酶和抗體的活性。1、酶標抗體：酶分子與抗體分子共價結(jié)合，要求此種結(jié)合既不改變52標記酶選擇標準：★該酶用細胞化學(xué)易于被檢出，能被光鏡或電鏡觀察?！锩阜磻?yīng)產(chǎn)物須穩(wěn)定，不擴散，具有良好定位。標記酶選擇標準：53

★酶易于純化，獲得純制品?！锩概c免疫球蛋白結(jié)合后，不喪失其活性。★酶在PH中性液內(nèi)較穩(wěn)定。★組織中不應(yīng)存在與底物作用的內(nèi)源性酶。

★酶易于純化，獲得純制品。54常用的標記酶辣根過氧化物酶堿性磷酸酶葡萄糖氧化酶常用的標記酶辣根過氧化物酶55（一）辣根過氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不會遮蓋抗原的結(jié)合部位，易穿過細胞膜★穩(wěn)定，耐受63℃加熱15min，易獲得較高純度酶★具有較高活性及特異性★可溶性佳，生成的產(chǎn)物不擴散★組織中內(nèi)源性酶較少★可作用于多種底物，產(chǎn)生不同顏色（一）辣根過氧化物酶（HRP）56HRP的底物：

HRP的底物為低濃度的H2O2顯色：DAB（二氨基聯(lián)苯胺）HRP的底物：57內(nèi)源性過氧化物酶的消除方法：

1.0.3%～3%H2O2甲醇液20min

2.1％H2O220min

3.3％苯肼溶液37℃1h

4.0.075%鹽酸甲醇液30min內(nèi)源性過氧化物酶的消除方法：

1.0.3%58（二）堿性磷酸酶（AKP）

從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取

●組織穿透能力較弱

●內(nèi)源性AKP較高

●左旋咪唑具有抑制作用

（二）堿性磷酸酶（AKP）59AKP底物：

AKP常用的底物為α-萘酚AS-B1磷酸鹽偶聯(lián)試劑：固蘭BB～藍色固紅TR～紅色

AKP底物：60內(nèi)源性堿性磷酸酶的消除方法

1.10％醋酸10min

2.0.5mol/L碳酸氫鈉（pH9.0）20min

3.1mol/L左旋咪唑20min內(nèi)源性堿性磷酸酶的消除方法

1.10％醋酸1061（三）葡萄糖氧化酶（GOD）

底物為葡萄糖，終產(chǎn)物穩(wěn)定●體內(nèi)無內(nèi)源性GOD●分子量大，穿透力較弱●分子具有較多的氨基，標記時容易形成廣泛的聚合，影響酶的活性。多用于雙標實驗（三）葡萄糖氧化酶（GOD）62酶標記抗體法

酶標記抗體法（EnzaymeLabelledantibody）是將酶通過共價鍵結(jié)合在抗體分子上，制備成酶標記抗體，通過抗體去尋找相應(yīng)抗原。

酶標記抗體法63一、直接法原理：HRP標記在特異性抗體（第一抗體）上抗原---抗體●HRP復(fù)合物一、直接法64組織抗原第一抗體過氧化物酶直接法組織抗原第一抗體過氧化物酶直接法65步驟：一步完成特點：方法簡便、省時，專一性強，非特異染色輕，但敏感性差，一種標記抗體只能檢測一種抗原。步驟：一步完成66二、間接法原理：HRP標記在第二抗體上，抗原---特異性抗體---第二抗體●

HRP復(fù)合物步驟：二步法二、間接法67組織抗原第一抗原第二抗體過氧化物酶間接法一抗和二抗必須是不同種屬的動物制備的，二抗是用第一種動物的IgG所制備的組織抗原第一抗原第二抗體過氧化物酶間接法一抗和二抗必須是不同68特點：敏感性較直接法高，一種標記抗體能用于相應(yīng)動物制備的多種特異性抗體，檢測多種抗原。但較直接法費時，非特異染色稍重。特點：敏感性較直接法高，一種標記抗體能用于相應(yīng)動物制備的多種69非標記抗體酶法（酶抗酶法）

酶不是作為標記物，而是作為抗原，用來制備抗這種酶的抗體酶橋法、PAP法

非標記抗體酶法（酶抗酶法）70酶橋法組織抗原第一抗體第二抗體（橋抗體）第三抗體（抗酶抗體）HRP一抗和三抗需用同一種屬動物制備二抗為抗上述動物IgG的抗體酶橋法組織抗原第一抗體第二抗體（橋抗體）第三抗體（抗酶抗體）71酶橋法的優(yōu)缺點優(yōu)點：酶未標記在任何抗體上，而是通過免疫學(xué)原理與抗體結(jié)合的，避免了共價結(jié)合對之的影響；靈敏度高缺點：1、抗酶抗體中有高、低親和力的兩類抗體。低親和力的抗體結(jié)合較弱，漂洗易丟失，降低敏感性2、抗酶抗體中，有非特異性抗體，其抗原性與抗酶抗體相同，也可與橋抗體結(jié)合，但不能與酶結(jié)合，影響抗原的顯示酶橋法的優(yōu)缺點優(yōu)點：酶未標記在任何抗體上，而是通過免疫學(xué)原理72PAP法原理：抗原---第一抗體---第二抗體（橋抗體）---PAP復(fù)合物步驟：三步法PAP法73PAP復(fù)合物酶（HRP）和抗酶抗體的復(fù)合物3個酶分子＋2個抗酶抗體優(yōu)點：結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沖洗時不會脫落；靈敏度大為提高；不易引起非特異性染色缺點：PAP復(fù)合物制備較復(fù)雜，分子較大，穿透力不強，不適合于電鏡標本PAP復(fù)合物酶（HRP）和抗酶抗體的復(fù)合物74組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物PAP法HRP一抗與PAP必須為同一種屬動物

二抗必須過量組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物PAP法HRP一抗與PA75雙PAP法：原理：在PAP的基礎(chǔ)上再重復(fù)第二抗體和PAP復(fù)合物抗原---特異性抗體---第二抗體（橋抗體）---PAP---第二抗體---PAP復(fù)合物

雙PAP法：76組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物雙PAP法HRP組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物雙PAP法HRP77雙PAP法組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物HRP雙PAP法組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物HRP78步驟：五步法特點：敏感性較高缺點：但步驟多，費時步驟：五步法79免疫親合技術(shù)原理：利用抗生物素（avidin）和生物素（biotin）的高親和力。1個抗生物素分子可結(jié)合4個生物素生物素可結(jié)合標記大分子如抗體、酶等抗生物素可用酶、膠體金、熒光色素等標記與免疫酶法沒有原則區(qū)別免疫親合技術(shù)80一、ABC法Avidin-Biotin-peroxidaseComplextechnique抗生物素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)一、ABC法81酶+Biotin＋Avidin---ABC復(fù)合物生物素化二抗抗原---特異抗體---Biotin標記的二抗---Avidin

●Biotin●HRP酶+Biotin＋Avidin---ABC復(fù)合物82組織抗原第一抗體第二抗體HRP生物素抗生物素ABC法組織抗原第一抗體第二抗體HRP生物素抗生物素ABC法83步驟：三步法特點：敏感性較高（比PAP高20－40倍）；特異性強；應(yīng)用范圍廣步驟：三步法84

●某些臟器存在內(nèi)源性生物素干擾（肝、腎、白細胞等）可預(yù)先用0.01％抗生物素和0.01％生物素溶液分別作用20min以消除，PBA沖洗干凈●抗生物素與核酸及細胞膜中磷脂有非特異反應(yīng)●某些臟器存在內(nèi)源性生物素干擾（肝、腎、白細胞85免疫組化染色步驟1．切片脫蠟入水，入PBS洗三次/15分鐘?？乖迯?fù)2．封閉內(nèi)源性過氧化物酶。用新配置的0.3％H2O2（在PBS或0.05Tris—HCL緩沖液pH7.6中或甲醇中）室溫，30分鐘。3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分鐘。4．減少非特異性著色：用稀釋5-20倍的正常血清（產(chǎn)生二次抗體動物血清！），室溫，30分鐘。免疫組化染色步驟86

5．滴加第一抗體，4℃過夜或室溫30′-3h。6．0.1MPBS，洗三次，每次5分鐘。7．滴加第二抗體，室溫15′-60′。8．0.1MPBS洗凈，洗三次，每次5分鐘。9．滴加ABC復(fù)合物，室溫15-60分鐘。10．0.1MPBS洗三次，每次5分鐘。

8711．0.05MTris–HCL5-10分鐘，此步可省略。12．DAB—H2O2顯色：用0.01％H2O2的DAB溶液，室溫5-30分鐘，隨時鏡檢（DAB用時新配）13．自來水洗凈。14．用Mayer蘇木精或0.5％甲基綠，復(fù)染胞核（可不染）。15．常規(guī)脫水、透明、封固、鏡檢。結(jié)果：棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原X的定位。11．0.05MTris–HCL5-10分鐘，此步可省88二、SABC法

StreptavidinbiotinPeroxidaseComplex（標記鏈霉抗生物素－生物素法）步驟相似，SABC法已代替ABC法二、SABC法89鏈霉親合素（鏈霉抗生物素）——從鏈霉菌分離出來的一種蛋白質(zhì)，與生物素也能特異性結(jié)合（4個結(jié)合位點）可以排除親合素（抗生物素）與一些組織的內(nèi)源性物質(zhì)非特異性結(jié)合鏈霉親合素（鏈霉抗生物素）——從鏈霉菌分離出來的一種蛋白質(zhì)，90多聚合物酶法原理：采用一種具有惰性的多聚化合物作為骨架，將特異性抗體和HRP，同時標記在多聚合物分子上，形成HRP---多聚合物---特異性抗體。

多聚合物酶法91組織抗原一抗HRP多聚骨架EPOS方法組織抗原一抗HRP多聚骨架EPOS方法92步驟：一步法特點：快速，簡便，特異性強，敏感性高但商品化種類不全，價格昂貴步驟：一步法93免疫組化染色基本技術(shù)注意事項1．Ab滴片技術(shù)所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。［注意］滴抗體前需把切片上的水甩干免疫組化染色基本技術(shù)注意事項942．Ab孵育技術(shù)（1）必須在濕盒內(nèi)進行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。（2）溫度與時間4℃：過夜，＞1637℃：1hor參考說明書3、整個染色過程不能干片免疫組織化學(xué)課件95▲染色失敗的幾種原因：（1）所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽性對照在內(nèi)。全部（－）原因可能：①染色未完全嚴格按照操作步驟進行；②漏加一種抗體，或抗體失效；③