《細(xì)胞工程》實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱（供四年制本科生物工程專(zhuān)業(yè)使用）

《細(xì)胞工程》實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱（供四年制本科生物工程專(zhuān)業(yè)使用）Ⅰ前言細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)講授以細(xì)胞和組織為研究和操作的基本對(duì)象、研究細(xì)胞工程操作過(guò)程中涉及到的細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基/液配制，滅菌/濾過(guò)除菌，植物組織培養(yǎng)、原代兔腎細(xì)胞培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)、增殖/轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：形態(tài)法；MTT法、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇等一系列問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞工程這一學(xué)科最重要研究方法，也是這一學(xué)科的支撐點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)課程是以細(xì)胞工程基本操作為主線(xiàn)，強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)方法的經(jīng)典性、實(shí)用性，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及了細(xì)胞培養(yǎng)的主要過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)課中的所有單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都屬于一個(gè)整體流程，通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)可提高學(xué)生的動(dòng)手操作能力、查閱文獻(xiàn)能力、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力、分析解決問(wèn)題的能力和綜合素質(zhì)，為學(xué)好后續(xù)課程，從事專(zhuān)業(yè)技術(shù)工作和科學(xué)研究打下必要的基礎(chǔ)。本大綱適用于四年制本科生物工程專(zhuān)業(yè)使用?，F(xiàn)將大綱使用中有關(guān)問(wèn)題說(shuō)明如下:一為了使教師和學(xué)生更好地掌握教材，大綱每一章節(jié)均由教學(xué)目的、教學(xué)要求和教學(xué)內(nèi)容三部分組成。教學(xué)目的注明教學(xué)目標(biāo)，教學(xué)要求分掌握、熟悉和了解三個(gè)級(jí)別，教學(xué)內(nèi)容與教學(xué)要求級(jí)別相對(duì)應(yīng)，并統(tǒng)一標(biāo)示(核心內(nèi)容即知識(shí)點(diǎn)以下劃實(shí)線(xiàn)，重點(diǎn)內(nèi)容以下劃虛線(xiàn)，一般內(nèi)容不標(biāo)示)便于學(xué)生重點(diǎn)學(xué)習(xí)。二教師在保證大綱核心內(nèi)容的前提下，可根據(jù)不同教學(xué)手段，講授重點(diǎn)內(nèi)容和介紹一般內(nèi)容，有的內(nèi)容可留給學(xué)生自學(xué)。二學(xué)時(shí):總教學(xué)參考時(shí)數(shù)100學(xué)時(shí)，其中理論課40學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)課60學(xué)時(shí)。三教材：《細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》李官成主編遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)Ⅱ正文實(shí)驗(yàn)一細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)備和準(zhǔn)備工作一教學(xué)目的通過(guò)本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)室有基本的認(rèn)識(shí)和了解，使學(xué)生掌握無(wú)菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌和儲(chǔ)藏等組成了細(xì)胞操作間。同時(shí)準(zhǔn)備一些瓶、皿為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。二教學(xué)要求（一）掌握：無(wú)菌操作區(qū)、凈化工作臺(tái)、使用凈化工作臺(tái)需注意的方面、倒置顯微鏡、C02培養(yǎng)箱、干燥箱、水純化裝置、冰箱、液氮罐、離心機(jī)、天平、消毒滅菌設(shè)備、培養(yǎng)用器皿。（二）熟悉：消毒滅菌設(shè)備、配液用具。（三）了解：細(xì)胞培養(yǎng)常用設(shè)備和器材匯總。三教學(xué)內(nèi)容（一）介紹細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置（無(wú)菌操作區(qū)、凈化工作臺(tái)、孵育區(qū)、制備區(qū)、儲(chǔ)藏區(qū)、清洗和消毒滅菌區(qū)）。（二）細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（倒置顯微鏡、C02培養(yǎng)箱、干燥箱、水純化裝置、冰箱、液氮罐、離心機(jī)、天平）（三）培養(yǎng)用器皿（培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板、貯液瓶、吸管、加樣器(移液器)、其他用品、器械）（四）細(xì)胞培養(yǎng)常用設(shè)備和器材匯總（大型設(shè)備工具類(lèi)、制備、培養(yǎng)、保存細(xì)胞用品、配液用具）。實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)用品清洗和消毒滅菌一教學(xué)目的組織細(xì)胞培養(yǎng)工作需要使用大量的器材,特別是玻璃器皿。培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌是一項(xiàng)重要而艱苦的任務(wù),通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)使學(xué)生掌握相關(guān)的用品清洗和消毒滅菌。二教學(xué)要求（一）掌握：培養(yǎng)用品清洗的過(guò)程和步驟、包裝、干燥、培養(yǎng)用品消毒滅菌、濕熱滅菌、過(guò)濾除菌。（二）熟悉：酸液的配制方法、紫外線(xiàn)消毒。（三）了解：干熱滅菌、消毒劑及抗生素、消毒方法選擇。三教學(xué)內(nèi)容（一）培養(yǎng)用品清洗：浸泡、刷洗、清潔液浸泡、沖洗。（二）掌握如下的步驟：1自來(lái)水漂洗:用洗衣粉擦洗(用手，不得使用毛刷),自來(lái)水漂洗，滴濾過(guò)夜。2自來(lái)水抽濾3～5遍至無(wú)白沫，水滴過(guò)夜。3清潔液抽濾1遍,清潔液滴濾過(guò)夜。4自來(lái)水漂洗抽濾5遍,水滴濾過(guò)夜。5蒸餾水抽濾3遍,蒸餾水滴濾過(guò)夜。6三蒸水抽濾2遍,三蒸水滴濾過(guò)夜,漂洗。7烤干備用。（三）示教包裝（四）培養(yǎng)用品消毒滅菌實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基/液配制一教學(xué)目的培養(yǎng)基(液)是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的基本溶液,是組織細(xì)胞培養(yǎng)最重要的條件?？煞譃樘烊慌囵B(yǎng)基及合成培養(yǎng)基兩大類(lèi)。實(shí)際工作中往往將天然培養(yǎng)基與人工合成培養(yǎng)液結(jié)合使用。通過(guò)本章的學(xué)習(xí)使學(xué)生掌握細(xì)胞培養(yǎng)的有關(guān)培養(yǎng)基的配制。二教學(xué)要求（一）掌握：血清、RPMI1640培養(yǎng)液、合成培養(yǎng)基(液)的配制過(guò)程。（二）熟悉：水解乳蛋白、合成培養(yǎng)基(液)基本成分、Ham培養(yǎng)液。（三）了解：血漿、組織浸出液、199培養(yǎng)液、Eagle培養(yǎng)液。三教學(xué)內(nèi)容（一）天然培養(yǎng)基：血清、血漿、組織浸出液、水解乳蛋白。（二）合成培養(yǎng)基(液)：合成培養(yǎng)基(液)基本成分。（三）常用的合成培養(yǎng)液(基)：199培養(yǎng)液、Eagle培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、Ham培養(yǎng)液。（四）合成培養(yǎng)基(液)的配制:用品、步驟、注意事項(xiàng)。（五）無(wú)血清培養(yǎng)基(液)：基礎(chǔ)培養(yǎng)液、輔加成分、培養(yǎng)基質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分、酶抑制劑。實(shí)驗(yàn)四植物組織培養(yǎng)及觀(guān)察一教學(xué)目的植物組織原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng),是從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步,是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作應(yīng)熟悉和掌握的最基本技術(shù)。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握原代培養(yǎng)細(xì)胞特點(diǎn)及應(yīng)用。二教學(xué)要求（一）掌握：培養(yǎng)室和超凈臺(tái)消毒、蘆薈、胡蘿卜的組織快的培養(yǎng)過(guò)程與步驟。（二）熟悉取材基本要求、組織塊分離方法。（三）了解取材基本器材和用品、培養(yǎng)前準(zhǔn)備。三教學(xué)內(nèi)容（一）蘆薈、胡蘿卜的清洗與消毒：水沖洗2小時(shí)、無(wú)菌水洗、75%酒精洗、0.1%HgCl洗30秒、在無(wú)菌水洗凈（二）取材基本要求：取材的組織最好盡快培養(yǎng)、取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作、盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。（三）取材基本器材和用品：1、眼科剪（直、彎）、鑷子（直、彎）、止血鉗、手術(shù)刀；2、裝有無(wú)血清培養(yǎng)基或Hank's液的小瓶；3、小燒杯(1Oml，5Oml)；4、培養(yǎng)皿等(特殊用途物品詳見(jiàn)后面章節(jié))。實(shí)驗(yàn)五原代兔腎細(xì)胞培養(yǎng)及觀(guān)察一教學(xué)目的原代培養(yǎng)是獲取細(xì)胞的主要手段,但原代培養(yǎng)的組織細(xì)胞比較復(fù)雜,由多種細(xì)胞成分組成,即使生長(zhǎng)出同一類(lèi)型細(xì)胞如成纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞,細(xì)胞間也存在很大差異。如果供體不同,即使組織類(lèi)型、部位相同,個(gè)體差別也可在細(xì)胞上反映出來(lái)。因而原代培養(yǎng)細(xì)胞部分生物學(xué)特征尚不穩(wěn)定,如要做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究,還需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短期傳代后進(jìn)行。原代培養(yǎng)方法很多,最基本和常用的方法有兩種,即組織塊法和消化法。通過(guò)本章的學(xué)習(xí)學(xué)生掌握兔腎細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程。二教學(xué)要求（一）掌握：兔腎細(xì)胞培養(yǎng)的用品：Hanks液(也可用無(wú)血清培養(yǎng)液)、培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶(必要時(shí)瓶?jī)?nèi)可放置小蓋玻片)、吸管、膠帽、小燒杯(20m1)或青霉素小瓶、眼科剪、5cm培養(yǎng)皿或小玻璃板(8×5cm2)、（二）熟悉：消化培養(yǎng)法、CO2培養(yǎng)相的使用。（三）了解：器官培養(yǎng)、瓊脂基質(zhì)培養(yǎng)法。三教學(xué)內(nèi)容（一）兔腎細(xì)胞培養(yǎng)的步驟：取材、修剪,將組織剪或切成1mm3左右的小塊。在剪切過(guò)程中,可適當(dāng)?shù)渭?～2滴培養(yǎng)液于組織上以保持濕潤(rùn)、將剪切好的組織小塊,用眼科鑷移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。用牙科針或彎頭吸管將組織塊在瓶壁上均勻擺置,每小塊間距5mm左右。量不宜過(guò)多,如50ml的培養(yǎng)瓶(底面積約為17.5cm2),放置20～30組織小塊為宜。也可放于瓶?jī)?nèi)預(yù)置的蓋玻片上。組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)讓瓶底朝上,注入適量培養(yǎng)液,蓋好瓶蓋,將培養(yǎng)瓶?jī)A斜放置在37℃溫箱內(nèi)、放置2～4h待組織小塊貼附后,再將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放（二）準(zhǔn)備兔腎細(xì)胞培養(yǎng)的用品。實(shí)驗(yàn)六淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)、增殖/轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（形態(tài)法；MTT法）一教學(xué)目的通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)是學(xué)生了解淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的基本方法與步驟，學(xué)習(xí)形態(tài)法觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。二教學(xué)要求（一）掌握：臺(tái)盼藍(lán)染色、MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞的分離。（二）熟悉：細(xì)胞分裂指數(shù)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制。（三）了解：伊紅染色試驗(yàn)。三教學(xué)內(nèi)容（一）淋巴細(xì)胞的分離：實(shí)驗(yàn)前腹腔注射1640待實(shí)驗(yàn)時(shí)腹腔取淋巴細(xì)胞。（二）MTT比色試驗(yàn)：接種細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、呈色、比色。（三）形態(tài)法：1.制備單個(gè)細(xì)胞懸液,并作適當(dāng)稀釋(10?/ml)。2.染色:取9滴細(xì)胞懸液移入小試管中,加1滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液,混勻。3.計(jì)數(shù):在3min內(nèi),用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)七懸浮、貼壁細(xì)胞株傳代培養(yǎng)、換液及觀(guān)察一教學(xué)目的培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶，生存的空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過(guò)程稱(chēng)傳代培養(yǎng)（subcultureorpassage）再培養(yǎng)的過(guò)程，即將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶分散轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。與細(xì)胞倍增（doubling）一代不同，在細(xì)胞傳代一代過(guò)程中，細(xì)胞倍增若干次。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)使學(xué)生掌握HeLa、SP2/0等細(xì)胞的培養(yǎng)、換液及觀(guān)察。二教學(xué)要求（一）掌握：貼壁傳代細(xì)胞培養(yǎng)及傳代（HeLa）、懸浮傳代細(xì)胞培養(yǎng)及傳代（SP2/0）。（二）熟悉：無(wú)菌操作。（三）了解：HeLa、SP2/0細(xì)胞生長(zhǎng)的特性與環(huán)境。三教學(xué)內(nèi)容（一）貼壁傳代細(xì)胞培養(yǎng)及傳代（HeLa）。（二）懸浮傳代細(xì)胞培養(yǎng)及傳代（SP2/0）。實(shí)驗(yàn)八細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇一教學(xué)目的通過(guò)本章的學(xué)習(xí)使學(xué)生掌握常用的細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇的操作步驟，熟悉細(xì)胞凍存液配制，液氮罐的使用。二教學(xué)要求（一）掌握：細(xì)胞凍存的方法和原則、細(xì)胞復(fù)蘇的方法和原則。（二）熟悉：細(xì)胞凍存液配制。（三）了解：液氮罐的使用。三教學(xué)內(nèi)容（一）細(xì)胞凍存的方法和原則。（二）細(xì)胞復(fù)蘇的方法和原則。（三）細(xì)胞凍存液配制。實(shí)驗(yàn)九骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)、換液及觀(guān)察細(xì)胞融合，選擇培養(yǎng)及觀(guān)察一教學(xué)目的掌握骨髓細(xì)胞制備及融合技術(shù)。二教學(xué)要求（一）掌握：骨髓瘤細(xì)胞的制備、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備、雜交瘤技術(shù)主要用品。（二）熟悉：免疫動(dòng)物及細(xì)胞融合、克隆化培養(yǎng)、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。（三）了解：篩選雜交瘤細(xì)胞。三教學(xué)內(nèi)容（一）骨髓瘤細(xì)胞的制備。（二）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備。（三）細(xì)胞融合技術(shù)。實(shí)驗(yàn)十基因轉(zhuǎn)染、克隆化培養(yǎng)（示教）一教學(xué)目的通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的示教，是學(xué)生了解基因轉(zhuǎn)染的方法與克隆化培養(yǎng)的技術(shù)，為以后的學(xué)習(xí)和科研工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。二教學(xué)要求（一）掌握：制備單克隆抗體、磷酸鈣共沉淀法。（二）熟悉：克隆化培養(yǎng)的原理、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA轉(zhuǎn)染法。（三）了解：雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定、單克隆抗體鑒定。三教學(xué)內(nèi)容（一）制備單克隆抗體。（二）單克隆抗體鑒定:抗體的特異性、抗體的類(lèi)別及亞類(lèi)抗體的中和活性、抗體的親和力、抗體對(duì)應(yīng)抗原的分子量、抗體識(shí)別的抗原表位。（三）磷酸鈣共沉淀法：原理、操作、注意事項(xiàng)。（四）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法:原理、操作、注意事項(xiàng)。Ⅲ教學(xué)組織與方法一實(shí)施機(jī)構(gòu)：由珠海校區(qū)生物工程教研室執(zhí)行。二組織內(nèi)容：教案講義審核、集體教學(xué)備課、教學(xué)方法研究、教學(xué)手段應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)預(yù)作。三教學(xué)方法：1采用啟發(fā)式、討論式課堂教學(xué)方式，輔助現(xiàn)代教育技術(shù)和傳統(tǒng)教學(xué)手段。核心內(nèi)容以講授為主，重點(diǎn)內(nèi)容以介紹為主，一般內(nèi)容以自學(xué)為主。2輔導(dǎo)形式：課堂討論、網(wǎng)絡(luò)查詢(xún)等相結(jié)合。3實(shí)驗(yàn)要求：實(shí)驗(yàn)前加強(qiáng)預(yù)習(xí)，實(shí)驗(yàn)中及時(shí)記錄；實(shí)驗(yàn)后及時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。四考核辦法：實(shí)驗(yàn)成績(jī)占期末總評(píng)成績(jī)的20%。包括三部分：課堂操作占20%，實(shí)驗(yàn)