臨床分子生物學(xué)檢驗實驗講義

實驗一實驗要求與生物安全（一）實驗前準(zhǔn)備——預(yù)習(xí)并復(fù)習(xí)PCR的反應(yīng)原理及基本過程（二）實驗要求——嚴(yán)肅認(rèn)真、安全規(guī)范1、不遲到早退、不無故缺席、按要求著白大褂2、保持安靜和秩序、不在教室接聽手機和喧嘩3、聽從安排，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程4、公用物品及時放回5、愛護儀器設(shè)備、保持清潔衛(wèi)生6、注重儀器和試劑使用的安全操作中注意事項：注意無菌操作并防止RNase污染注意移液器（槍）的使用注意離心機必須平衡防止試劑造成皮膚傷害實驗二乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴增(PCR)熒光定量檢測【標(biāo)本采集】樣品可采用血清或血漿樣本，血漿采用3%枸櫞酸鈉抗凝，抗凝劑：血液為1：9?！静僮鞑襟E】待測樣品處理（將［陰性對照］、［工作標(biāo)準(zhǔn)品①］、［工作標(biāo)準(zhǔn)品②］、［工作標(biāo)準(zhǔn)品③］、［工作標(biāo)準(zhǔn)品④］與待測標(biāo)本同步進(jìn)行處理）(在標(biāo)本處理區(qū)進(jìn)行)1.1用帶濾芯吸嘴吸取100μl［樣品處理液A］于0.5ml離心管中。1.2加入100μl被測標(biāo)本。1.3蓋上管蓋，振蕩混勻，13000rpm離心10分鐘（離心時固定離心管方向）。1.4吸棄上清（沉淀不明顯，需在離心管底部沉淀對側(cè)吸上清，應(yīng)一次吸盡上清，避免攪動或碰到沉淀）。1.5再加入25μl［樣品處理液B］。1.6振蕩混勻，低速（2000rpm）離心數(shù)秒后，100℃干浴或沸水浴101.713000rpm離心10分鐘，取上清為PCR反應(yīng)模板。（上清如不立即使用，須置-20℃保存,重新使用時需13000rpm離心102.PCR試劑準(zhǔn)備（在PCR前準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）2.1取試劑盒中［PCR反應(yīng)液A］、［PCR反應(yīng)液B］、［PCR反應(yīng)液C］室溫融化混勻后，低速（2000rpm）離心數(shù)秒。2.2根據(jù)待擴增樣品數(shù)按［PCR反應(yīng)液A］：［PCR反應(yīng)液B］：［PCR反應(yīng)液C］=13.5：13.5：1的比例配制PCR反應(yīng)液，并分裝至PCR反應(yīng)管中，每管28μl，將裝有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)。3.加樣（在標(biāo)本處理區(qū)進(jìn)行）在裝有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別加入2μl已處理好的標(biāo)本（標(biāo)本處理步驟1.7的上清）。蓋上管蓋，轉(zhuǎn)移到擴增檢測區(qū)。4.PCR擴增檢測（在擴增檢測區(qū)進(jìn)行）將反應(yīng)管放入熒光PCR擴增儀進(jìn)行擴增檢測。循環(huán)參數(shù)設(shè)定：（請參照各類儀器的操作軟件進(jìn)行設(shè)置）步驟溫度時間循環(huán)數(shù)1UNG酶反應(yīng)502分鐘12預(yù)變性942分鐘13變性9410秒40退火、延伸及檢測熒光6030秒4儀器冷卻3510秒1步驟3中60℃時熒光檢測，檢測通道：530nm（FAM）4.3樣品設(shè)置在儀器軟件的相應(yīng)樣品設(shè)置窗口內(nèi)填寫各樣品的名稱、類型及工作標(biāo)準(zhǔn)品參數(shù)（見試劑盒內(nèi)提示）?！窘Y(jié)果分析】根據(jù)各類儀器的軟件進(jìn)行分析，得到各標(biāo)本的HBVDNA檢測結(jié)果。（基線選取6～10或6～15個循環(huán)，閾值線選在陰性對照正常擴增曲線的上方）【結(jié)果判斷】1.對于500≤測定拷貝數(shù)＜108拷貝/ml的樣本，報告相應(yīng)的測定結(jié)果。2.對于測定拷貝數(shù)≥108拷貝/ml的樣本，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明≥108拷貝/ml。若需精確定量，可根據(jù)所測結(jié)果，將該標(biāo)本用陰性血清稀釋至105～106拷貝/ml后復(fù)測。3.對于測定拷貝數(shù)＜500拷貝/ml的樣本，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明＜500拷貝/ml或低于試劑盒檢測下限。4.對于HBV擴增陰性的標(biāo)本（Ct無數(shù)值），報告上注明＜500拷貝/ml或低于試劑盒檢測下限?！咀⒁馐马棥?.待檢新鮮血清或血漿若不及時檢測,應(yīng)保存于-20℃。2.試劑盒各組份使用前請充分融化并搖勻,離心管內(nèi)的試劑需離心數(shù)秒后使用。3.PCR操作各階段應(yīng)在不同實驗區(qū)域進(jìn)行，包括PCR擴增試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)及PCR擴增檢測區(qū)。4.在標(biāo)本處理階段建議使用負(fù)壓超凈臺。5.應(yīng)穿工作服，戴一次性手套（經(jīng)常替換手套），使用一次性用品。6.PCR操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗和受過培訓(xùn)。7.操作過程中用到的超凈臺、移液器、離心機、擴增儀等儀器設(shè)備應(yīng)經(jīng)常用10%次氯酸或70%乙醇及紫外燈處理。8.實驗中廢棄的吸嘴應(yīng)棄于含10%次氯酸的廢液缸中,以防止污染。9.陰性對照、工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)和待檢標(biāo)本平行進(jìn)行操作后方可進(jìn)行PCR擴增。10.使用本試劑盒檢測，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程操作。11.血清標(biāo)本的測定結(jié)果比血漿標(biāo)本測定結(jié)果略低。實驗三丙型肝炎病毒核酸擴增(PCR)-熒光定量檢測原理與用途本品從血清或血漿中提取HCVRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下將RNA逆轉(zhuǎn)錄為HCVcDNA，在引物的指導(dǎo)下，以四種脫氧核苷酸為底物，通過耐熱DNA聚合酶的酶促作用，對cDNA進(jìn)行體外擴增。用Taqman探針法檢測擴增產(chǎn)物。工作標(biāo)準(zhǔn)品為HCVRNA，采用外標(biāo)的方法定標(biāo)。本品的定量檢測范圍為103～107IU/ml，本品用于定量檢測血清或血漿標(biāo)本中的丙型肝炎病毒RNA，可作為丙型肝炎的輔助診斷及療效監(jiān)控。樣本種類、采集和保存方法至-80℃凍存。標(biāo)本應(yīng)于操作步驟標(biāo)本處理(所有操作需采用無RNA酶的帶濾芯吸嘴及離心管，在標(biāo)本處理區(qū)進(jìn)行)實驗前準(zhǔn)備1.1將裂解液置70℃加熱5分鐘，使試劑瓶內(nèi)的結(jié)晶全部溶解。吸取1ml裂解液加到助沉劑的試劑瓶中，用吸嘴攪動，混勻后全部吸回到裂解液瓶中，混勻后備用。1.2在去抑制劑的試劑瓶中加入700用吸嘴攪動，1.3在洗滌液A的瓶子中加入6ml無水乙醇，顛倒混勻后備用。1.4在洗滌液B的瓶子中加入16ml無水乙醇，顛倒混勻后備用。2病毒RNA提取2.1取N個0.5ml離心管（N=標(biāo)本數(shù)量+陰性對照、強陽性對照、弱陽性對照和4個工作標(biāo)準(zhǔn)品），作好標(biāo)記后分別加入100入100入20去抑制劑用帶濾芯吸嘴加入110無水乙醇，振蕩混勻，離心數(shù)秒。2.5將作好標(biāo)記的核酸提取柱插入連接管后，固定在負(fù)壓裝置上，將步驟2.4中的所有液體小心移入核酸提取柱。注意不要將液體濺入其它樣品的核酸提取柱內(nèi)。2.6開啟負(fù)壓，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。2.7在每個核酸提取柱內(nèi)加入500μl洗滌液A，開啟負(fù)壓，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。2.8在每個核酸提取柱內(nèi)加入500μl洗滌液B，開啟負(fù)壓，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。2.9從連接套管上取下核酸提取柱，將其放入無RNA酶的2ml離心管中，蓋上管蓋，14000rpm離心1分鐘。2.10將提取柱放入一新的2ml離心管中（確保采用無RNA酶的離心管），小心將50μl洗脫液加在柱面中央，靜置1分鐘。2.11蓋上管蓋，10000rpm離心1分鐘，取2ml離心管中的收集液12.5μl做PCR反應(yīng)模板。RT-PCR試劑準(zhǔn)備（在PCR前準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）從試劑盒中取出PCR主反應(yīng)液、酶混合物和熒光探針,室溫下融化后離心數(shù)秒,按照待擴增標(biāo)本數(shù)量x，取PCR主反應(yīng)液:酶混合物:熒光探針=7:5:0.5混合，充分混勻后離心數(shù)秒，分裝至PCR毛細(xì)反應(yīng)管中，每管12.5μl，將裝有PCR反應(yīng)液的毛細(xì)反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)。RT-PCR擴增反應(yīng)液配制表擴增樣品數(shù)PCR主反應(yīng)液酶混合物熒光探針合計1077μl55μl5.5μl137.5μl20154μl110μl11μl275μl30231μl165μl16.5μl412.5μl32245μl175μl17.5μl437.5μl加樣（在標(biāo)本處理區(qū)進(jìn)行）1.在裝有PCR反應(yīng)液的毛細(xì)反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別加入12.5μl已處理好的標(biāo)本（標(biāo)本處理步驟2.11離心管中的洗脫液）。蓋上管蓋，離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移到擴增檢測區(qū)。PCR擴增檢測（在擴增檢測區(qū)進(jìn)行）1.將毛細(xì)管放入LightCycler擴增儀進(jìn)行擴增檢測。2.循環(huán)參數(shù)設(shè)定：ProgramCyclesTemperatureTarget（℃）HoldTime（min：sec）Slope（℃/sec）AcquisitionMode115025：0020None21942：0020None3593320None55152None721520None44293320None604520Single51403020None3.熒光檢測通道：F1。結(jié)果獲取1.選F1或F1/F2通道，點擊Quantification按紐，進(jìn)入數(shù)據(jù)分析界面。2.在數(shù)據(jù)分析窗口中，將噪音線NoiseBand的位置移至剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點，且CT值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準(zhǔn)（可根據(jù)儀器本身的實際情況加以調(diào)整），得到各標(biāo)本的HCVRNA檢測結(jié)果。結(jié)果判斷本品的檢測靈敏度為500IU/ml，定量測定范圍為103～107IU/ml。1.定性結(jié)果判斷：測定結(jié)果為0（無數(shù)值）的標(biāo)本為HCVRNA陰性標(biāo)本。測定結(jié)果≥500IU/ml的標(biāo)本為HCVRNA陽性標(biāo)本。2.定量結(jié)果判斷：對于103≤測定結(jié)果≤107IU/ml的樣本，提示本次測定結(jié)果在試劑盒有效定量檢測線性范圍內(nèi)。報告上注明其測定結(jié)果。對于測定結(jié)果＞107IU/ml的樣本，提示病毒含量高于試劑盒定量檢測線性范圍上限，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明＞107IU/ml。若需精確定量，可根據(jù)所測結(jié)果，將該標(biāo)本用陰性血清稀釋至104～106IU/ml后復(fù)測。對于500≤測定結(jié)果＜103IU/ml的樣本，提示病毒含量低于試劑盒定量檢測線性范圍下限，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明＜103IU/ml,建議隨訪。測定結(jié)果為0(無數(shù)值)的標(biāo)本為HCVRNA陰性標(biāo)本。注意事項1待檢新鮮血標(biāo)本若不及時檢測,應(yīng)保存于-20℃2試劑盒各組份使用前請充分融化并搖勻,離心管內(nèi)的試劑需離心數(shù)秒后使用。3PCR操作各階段應(yīng)