MLST方法原理、數(shù)據(jù)處理及應用介紹課件

MLST方法原理及應用介紹中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室周海健MLST方法原理及應用介紹中國疾病預防控制中心傳染病預防控制1分型方法分辨力分型力可重復性可比性操作難易程度一次實驗周期實驗通量實驗費用*核糖體分型（Ribotyping）好好好中等一般一天小低隨機擴增PCR（RAPD）一般好一般中等容易一天大低擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）較好較好好中等一般兩天中等中等多位點序列分型（MLST）一般好好好一般>兩天大高脈沖場凝膠電泳（PFGE）較好較好較好較好一般兩天小中等多位點串聯(lián)重復序列（MLVA）較好較好較好較好一般一天大低常用細菌分子分型方法的比較

分型方法分辨力分型力可重復2分子分型主要的三種實驗數(shù)據(jù)形式1.圖像數(shù)據(jù)：

脈沖場凝膠電泳（PFGE)隨機擴增多態(tài)性DNA分析（RAPD)擴增片斷長度多態(tài)性分析（AFLP）核糖體分型（Ribotyping）2.分類數(shù)據(jù)：

多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析（MLVA）多位點序列分析（MLST）單堿基核苷酸多態(tài)性分析（SNP）3.序列數(shù)據(jù)：全基因測序特異基因、基因簇測序（如軍團菌的mip基因測序、腦膜炎奈瑟菌的PorA和FetA分型、16srRNA基因測序）分子分型主要的三種實驗數(shù)據(jù)形式1.圖像數(shù)據(jù)：3分型的三個層次相似度比較（Pairwisesimilarities）種群結(jié)構(gòu)分析（Populationmodelling）遺傳進化關系分析（Evolutionarymodelling）分型的三個層次相似度比較（Pairwisesimilari4PFGE:引起兩株細菌分型數(shù)據(jù)不同的遺產(chǎn)事件MLVA：VNTR位點滑鏈突變MLST：管家基因的點突變大片段的插入、缺失、重組等酶切位點的點突變質(zhì)粒的獲得、丟失PFGE:引起兩株細菌分型數(shù)據(jù)不同的遺產(chǎn)事件MLVA：VNT5MLST基本原理菌株編號abcZadkaroEfumCgdhpdhCpgmMLST型NM20110111213219ST-7NM2011022343846ST-11NM2011032343846ST-11NM201104222358275305255ST-4821細菌染色體abcZ

測序結(jié)果123222222222MLST基本原理菌株編號abcZadkaroEfumCgdh6DNA提取管家基因擴增分離鑒定標本采集可靠的序列MLST分型流程序列分析純菌培養(yǎng)測序構(gòu)樹DNA提取管家基因擴增分離鑒定標本采集可靠的序列MLST分型7（1）已分離到細菌：細菌培養(yǎng)，提取DNA。用試劑盒或者水煮法提取均可以。（2）未分離到細菌的標本（腦脊液、血液、咽拭子、肺泡灌洗液等）：用標本直接提取細菌DNA，只能用試劑盒提取。DNA提?。?）已分離到細菌：細菌培養(yǎng)，提取DNA。用試劑盒或者水煮法8/neisseria腦膜炎奈瑟菌MLST數(shù)據(jù)庫/流感嗜血桿菌MLST數(shù)據(jù)庫.uk/legionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.php嗜肺軍團菌SBT（MLST）分型數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站提交獲得分型結(jié)果http://mlst.ucc.ie/沙門氏菌MLST數(shù)據(jù)庫/neisseriaht9MLST結(jié)果MLST適合用于長期的、大范圍的流行病學調(diào)查和監(jiān)測菌群結(jié)構(gòu)變化，研究地域性傳播和流行性變遷。管家基因序列的變化速率慢，多態(tài)性相對于其他基因組分更小，目前認為MLST不能單獨作為暴發(fā)溯源的工具。兩株細菌MLST分型結(jié)果相同，表示這兩株細菌屬于相同的克隆或者克隆群，不能認為他們之間有流行病學聯(lián)系。MLST結(jié)果MLST適合用于長期的、大范圍的流行病學調(diào)查和監(jiān)102005-2012年234株腦膜炎奈瑟菌MLST分析MLST應用實例一：腦膜炎奈瑟菌種群結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀分析2005-2012年234株腦膜炎奈瑟菌MLST分析MLST111956-2012年流腦主要血清群流行菌株分子型別變遷MLST應用實例二：腦膜炎奈瑟菌菌群變遷1956-2012年流腦主要血清群流行菌株分子型別變遷MLS12MLST應用實例三：環(huán)境軍團菌菌群結(jié)構(gòu)分析2005-2012年中國7個城市環(huán)境分離164株血清1型嗜肺軍團菌種群結(jié)構(gòu)特征MLST應用實例三：環(huán)境軍團菌菌群結(jié)構(gòu)分析2005-201213中、日、韓三國環(huán)境分離血清1型嗜肺軍團菌種群結(jié)構(gòu)特征中、日、韓三國環(huán)境分離血清1型嗜肺軍團菌種群結(jié)構(gòu)特征14MLST應用實例四：霍亂弧菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析160株O1群霍亂弧菌MLST分析最小生成樹160株O1群霍亂弧菌MLST分析Neighbor-joining樹MLST應用實例四：霍亂弧菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析160株O1群霍15MLST應用實例五：副溶血弧菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析MLST應用實例五：副溶血弧菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析16謝謝謝謝17無法區(qū)分：分離株有相同的帶型，包括條帶的數(shù)目和位置。這些分離株為同一菌株。高度相關：如果PFGE帶型僅有因一次基因事件引起的帶型變化，這些菌株就被定義為高度相關菌株。這些僅有兩到三個條帶變化的情況常見于反復傳代以及從同一病人中多次分離的菌株?？赡芟嚓P：PFGE帶型與爆發(fā)菌株帶型變化有兩個獨立的基因事件引起的條帶變化。（通常是4到6個條帶的變化）。這些分離株可能是遺傳上相關的，但是并不是緊密相關的，其流行病學關系也并不緊密。這樣的突變常見于分離自較長的時間段（大于等于6個月）或者是大規(guī)模延伸爆發(fā)的病人中。無關：三個獨立的基因事件引起的條帶變化（7個或者是以上的條帶變化）。PFGE結(jié)果判讀：TENOVER原則TENOVER原則的前提：菌株是同一暴發(fā)期間分離的無法區(qū)分：分離株有相同的帶型，包括條帶的數(shù)目和位置。這些分離18關于分型方法使用的建議暴發(fā)調(diào)查所有菌株進行PFGE，挑選代表菌株進行MLST；對于細菌特異性引物PCR擴增陽性的標本未能分離菌株的，進行MLST分型。個案調(diào)查所有菌株進行PFGE和MLST分型；對于細菌特異性引物PCR擴增陽性的標本未能分離菌株的，進行MLST分型。全國范圍的、長期的流行情況調(diào)查所有菌株進行PFGE，挑選代表菌株進行MLST分型。關于分型方法使用的建議暴發(fā)調(diào)