離子交換層析講解課件

離子交換層析原理及應(yīng)用離子交換層析原理及應(yīng)用1一、簡(jiǎn)介1、定義：離子交換層析（IonExchangeChromatography簡(jiǎn)稱(chēng)為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法一、簡(jiǎn)介1、定義：22、發(fā)展歷程1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過(guò)程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀(jì)40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹(shù)脂。50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類(lèi)、核苷酸等的分離純化。2、發(fā)展歷程1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物3二、基本原理離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類(lèi)不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過(guò)一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。二、基本原理離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換4二、基本原理電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱(chēng)為陽(yáng)離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱(chēng)為陰離子交換劑二、基本原理電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可5二、基本原理其中R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)；X-和X+分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)，Y+和Y-分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子；A+和A-分別代表溶液中的離子基團(tuán)。（如下圖）：二、基本原理其中R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)；6示意圖：RX-

Y+?A+

X+

Y-?A-

示意圖：RX-Y+?A+X+Y-?A-7二、基本原理從上面的反應(yīng)式中可以看出，如果A離子與離子交換劑的結(jié)合力強(qiáng)于Y離子，或者提高A離子的濃度，或者通過(guò)改變其它一些條件，可以使A離子將Y離子從離子交換劑上置換出來(lái)。也就是說(shuō)，在一定條件下，溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來(lái)，并通過(guò)電荷基團(tuán)結(jié)合到固定相上，而平衡離子則進(jìn)入流動(dòng)相，這就是離子交換層析的基本置換反應(yīng)。通過(guò)在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對(duì)溶液中不同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。下面以陰離子交換劑為例簡(jiǎn)單介紹離子交換層析的基本分離過(guò)程。二、基本原理從上面的反應(yīng)式中可以看出，如果A離子與離子交換劑8二、基本原理

陰離子交換陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，裝柱平衡后，與緩沖溶液中的帶負(fù)電的平衡離子結(jié)合。待分離溶液中可能有正電基團(tuán)、負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)。加樣后，負(fù)電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交換劑上。而正電基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交換劑結(jié)合，隨流動(dòng)相流出而被去除。二、基本原理

陰離子交換9二、基本原理

陰離子交換通過(guò)選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)進(jìn)行交換，而將各種負(fù)電基團(tuán)置換出來(lái)，隨洗脫液流出。與離子交換劑結(jié)合力小的負(fù)電基團(tuán)先被置換出來(lái)，而與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的需要較高的離子強(qiáng)度才能被置換出來(lái)，這樣各種負(fù)電基團(tuán)就會(huì)按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離目的。二、基本原理

陰離子交換通過(guò)選10二、基本原理各種離子與離子交換劑上的電荷基團(tuán)的結(jié)合是由靜電力產(chǎn)生的，是一個(gè)可逆的過(guò)程。結(jié)合的強(qiáng)度與很多因素有關(guān)，包括離子交換劑的性質(zhì)、離子本身的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結(jié)合力的差異，并通過(guò)改變離子強(qiáng)度、pH等條件改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力而達(dá)到分離的目的。二、基本原理各種離子與離子交換劑上的電荷基團(tuán)的結(jié)合是由靜電力11二、基本原理離子交換劑的電荷基團(tuán)對(duì)不同的離子有不同的結(jié)合力。一般來(lái)講，離子價(jià)數(shù)越高，結(jié)合力越大；價(jià)數(shù)相同時(shí)，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越大。如陽(yáng)離子交換劑對(duì)離子的結(jié)合力順序?yàn)椋篖i+蛋白質(zhì)等生物大分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結(jié)合與它們的性質(zhì)及pH有較大關(guān)系。以用陽(yáng)離子交換劑分離蛋白質(zhì)為例，在一定的pH條件下，等電點(diǎn)pI高于pH的蛋白帶正電，能與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合，一般pI越高的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。而實(shí)際上，由于生物樣品的復(fù)雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結(jié)合情況較難估計(jì)，往往要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。二、基本原理離子交換劑的電荷基團(tuán)對(duì)不同的離子有不同的結(jié)合力。12三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)可三方面性質(zhì)對(duì)離子交換劑進(jìn)行分類(lèi)：1.離子交換劑的基質(zhì)2.離子交換劑的電荷基團(tuán)3.交換容量三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)可三方面性質(zhì)對(duì)離子交換劑進(jìn)行分類(lèi)：13三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)1.離子交換劑的基質(zhì)離子交換劑的大分子聚合物基質(zhì)可以由多種材料制成，如：聚苯乙烯離子交換劑、纖維素（Cellulose）、球狀纖維素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖（Sepharose）等等。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)1.離子交換劑的基質(zhì)14三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

1.離子交換劑的基質(zhì)其中：聚苯乙烯離子交換劑（又稱(chēng)為聚苯乙烯樹(shù)脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯為基質(zhì)。聚苯乙烯離子交換劑機(jī)械強(qiáng)度大、流速快。但它與水的親和力較小，具有較強(qiáng)的疏水性，容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無(wú)機(jī)離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素（Cellulose）、球狀纖維素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖（Sepharose）為基質(zhì)的離子交換劑都與水有較強(qiáng)的親和力，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，葡聚糖離子交換劑一般以SephadexG－25和G－50為基質(zhì)，瓊脂糖離子交換劑一般以SepharoseCL－6B為基質(zhì)。關(guān)于這些離子交換劑的性質(zhì)可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

1.離子交換劑的基質(zhì)其中：聚苯15三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)根據(jù)與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)的性質(zhì)，可以將離子交換劑分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。陽(yáng)離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，可以交換陽(yáng)離子物質(zhì)。陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，可以交換陰離子物質(zhì)。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)根據(jù)與16三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)陽(yáng)離子交換劑：根據(jù)電荷基團(tuán)的解離度不同，陽(yáng)離子交換劑可以分為強(qiáng)酸型、中等酸型和弱酸型三類(lèi)。它們的區(qū)別在于它們電荷基團(tuán)完全解離的pH范圍，強(qiáng)酸型離子交換劑在較大的pH范圍內(nèi)電荷基團(tuán)完全解離，而弱酸型完全解離的pH范圍則較小，如羧甲基在pH小于6時(shí)就失去了交換能力。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)陽(yáng)離子17三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)陽(yáng)離子交換劑：一般結(jié)合磺酸基團(tuán)（-SO3H），如磺酸甲基（簡(jiǎn)寫(xiě)為SM）、磺酸乙基（SE）等為強(qiáng)酸型離子交換劑，結(jié)合磷酸基團(tuán)（-PO3H2）和亞磷酸基團(tuán)（-PO2H）為中等酸型離子交換劑，結(jié)合酚羥基（-OH）或羧基（-COOH），如羧甲基（CM）為弱酸型離子交換劑。一般來(lái)講強(qiáng)酸型離子交換劑對(duì)H離子的結(jié)合力比Na+離子小，弱酸型離子交換劑對(duì)H離子的結(jié)合力比Na+離子大。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)陽(yáng)離子18三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)陰離子交換劑：同樣根據(jù)電荷基團(tuán)的解離度不同，可以分為強(qiáng)堿型、中等堿型和弱堿型三類(lèi)。一般結(jié)合季胺基團(tuán)（-N(CH3)3），如季胺乙基（QAE）為強(qiáng)堿型離子交換劑，結(jié)合叔胺（-N(CH3)2）、仲胺（-NHCH3）、伯胺（-NH2）等為中等或弱堿型離子交換劑，如結(jié)合二乙基氨基乙基（DEAE）為弱堿型離子交換劑。一般來(lái)講強(qiáng)堿型離子交換劑對(duì)OH離子的結(jié)合力比Cl離子小，弱酸型離子交換劑對(duì)OH離子的結(jié)合力比Cl離子大三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)陰離子19三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力。通常所說(shuō)的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱(chēng)為總交換容量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中關(guān)心的是層析柱與樣品中各個(gè)待分離組分進(jìn)行交換時(shí)的交換容量，它不僅與所用的離子交換劑有關(guān)，還與實(shí)驗(yàn)條件有很大的關(guān)系，一般又稱(chēng)為有效交換容量。后面提到的交換容量如未經(jīng)說(shuō)明都是指有效交換容量。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量交換容量是指離子交換20三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量影響因素：影響交換容量的因素很多，主要可以分為兩個(gè)方面：一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進(jìn)行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當(dāng)然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應(yīng)盡量能夠讓樣品組分進(jìn)入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量影響因素：21三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量影響因素：分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因?yàn)樾》肿涌梢宰杂傻倪M(jìn)入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。對(duì)于較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因?yàn)閷?duì)于很大的分子，一般不能進(jìn)入孔隙內(nèi)部，交換只限于顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑表面積大。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量影響因素：22三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量影響因素：另一項(xiàng)影響因素如實(shí)驗(yàn)中的離子強(qiáng)度、pH值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般pH對(duì)弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對(duì)于弱酸型離子交換劑在pH較高時(shí)，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH時(shí)，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量小。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量影響因素：23三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量影響因素：同時(shí)pH也影響樣品組分的帶電性。尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在離子交換層析中要選擇合適的pH以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結(jié)合。一般來(lái)說(shuō)，離子強(qiáng)度增大，交換容量下降。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要降低交換容量以將結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來(lái)。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量影響因素：24三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)（meq/mg或meq/ml）來(lái)表示。通?？梢杂傻味ǚy(cè)定。陽(yáng)離子交換劑首先用HCl處理，使其平衡離子為H+。再用水洗至中性，對(duì)于強(qiáng)酸型離子交換劑，用NaCl充分置換出H+，再用標(biāo)準(zhǔn)濃度的NaOH滴定生成的HCl，就可以計(jì)算出離子交換劑的交換容量；對(duì)于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將H+充分置換出來(lái)，再用酸滴定，計(jì)算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。陰離子交換劑的交換容量也可以用類(lèi)似的方法測(cè)定。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量離子交換劑的總交換容25三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量對(duì)于一些常用于蛋白質(zhì)分離的離子交換劑也通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質(zhì)的量來(lái)表示，一般這種表示方法對(duì)于分離蛋白質(zhì)等生物大分子具有更大的參考價(jià)值。實(shí)驗(yàn)前可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹了解各種離子交換劑的交換容量。三、離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì)

3.交換容量對(duì)于一些常用于蛋白質(zhì)26四、離子交換劑的選擇、處理和保存1.離子交換劑的選擇離子交換劑的種類(lèi)很多，離子交換層析要取得較好的效果首先要選擇合適的離子交換劑。四、離子交換劑的選擇、處理和保存1.離子交換劑的選擇27四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇首先是對(duì)離子交換劑電荷基團(tuán)的選擇，確定是選擇陽(yáng)離子交換劑還是選擇陰離子交換劑。這要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽(yáng)離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇首先是28四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇首先是對(duì)離子交換劑電荷基團(tuán)的選擇：例如待分離的蛋白等電點(diǎn)為4，穩(wěn)定的pH范圍為6－9，由于這時(shí)蛋白帶負(fù)電，故應(yīng)選擇陰離子交換劑進(jìn)行分離。強(qiáng)酸或強(qiáng)堿型離子交換劑適用的pH范圍廣，常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH下的分離。由于弱酸型或弱堿型離子交換劑不易使蛋白質(zhì)失活，故一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇首先是29四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇其次是對(duì)離子交換劑基質(zhì)的選擇。前面已經(jīng)介紹了，聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強(qiáng)的離子交換劑一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無(wú)機(jī)離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑親水性較強(qiáng)，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇其次是30四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇其次是對(duì)離子交換劑基質(zhì)的選擇。一般纖維素離子交換劑價(jià)格較低，但分辨率和穩(wěn)定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價(jià)格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強(qiáng)度和pH變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機(jī)械穩(wěn)定性較好，分辨率也較高，但價(jià)格較貴。四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇其次是31四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇另外離子交換劑顆粒大小也會(huì)影響分離的效果。離子交換劑顆粒一般呈球形，顆粒的大小通常以目數(shù)（mesh）或者顆粒直徑（mm）來(lái)表示，目數(shù)越大表示直徑越小。前面在介紹交換容量時(shí)提到了一些關(guān)于交換劑顆粒大小、孔隙的選擇。另外離子交換層析柱的分辨率和流速也都與所用的離子交換劑顆粒大小有關(guān)。四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇另外離32四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇另外離子交換劑顆粒大小也會(huì)影響分離的效果。一般來(lái)說(shuō)顆粒小，分辨率高，但平衡離子的平衡時(shí)間長(zhǎng)，流速慢；顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑適合于對(duì)分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離，而小顆粒的離子交換劑適于需要高分辨率的分析或分離。四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇另外離33四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇四：常用的層析介質(zhì)這里特別要提到的是，離子交換纖維素目前種類(lèi)很多，其中以DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）和CM-纖維素（羧甲基纖維素）最常用，它們?cè)谏锎蠓肿游镔|(zhì)（蛋白質(zhì)，酶，核酸等）的分離方面顯示很大的優(yōu)越性。四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇四：常34四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇四：常用的層析介質(zhì)一是它具有開(kāi)放性長(zhǎng)鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，大分子可自由通過(guò)，使它的實(shí)際交換容量要比離子交換樹(shù)脂大的多；二是它具有親水性，對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達(dá)到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為非常重要的一類(lèi)離子交換劑。四、離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇四：常35四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存①處理：離子交換劑使用前一般要進(jìn)行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進(jìn)行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來(lái)。而后用水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽(yáng)離子交換劑為Na型（即平衡離子是Na離子），陰離子交換劑為Cl型，因?yàn)橥ǔ＿@樣比較穩(wěn)定。四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存①36四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存①處理：處理時(shí)一般陽(yáng)離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是HCl，堿是NaOH或再加一定的NaCl，這樣處理后陽(yáng)離子交換劑為Na型，陰離子交換劑為Cl型。使用的酸堿濃度一般小于0.5mol/L，浸泡時(shí)間一般30min。處理時(shí)應(yīng)注意酸堿濃度不宜過(guò)高、處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)、溫度不宜過(guò)高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會(huì)影響分離效果。四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存①37四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存②再生：離子交換劑的再生是指對(duì)使用過(guò)的離子交換劑進(jìn)行處理，使其恢復(fù)原來(lái)性狀的過(guò)程。前面介紹的酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。離子交換劑的轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子的過(guò)程。如對(duì)陰離子交換劑用HCl處理可將其轉(zhuǎn)為Cl型，用NaOH處理可轉(zhuǎn)為OH型，用甲酸鈉處理可轉(zhuǎn)為甲酸型等等。對(duì)離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型的目的是一致的，都是為了使離子交換劑帶上所需的平衡離子。四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存②38四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存②再生：前面已經(jīng)介紹了，離子交換層析就是通過(guò)離子交換劑上的平衡離子與樣品中的組分離子進(jìn)行可逆的交換而實(shí)現(xiàn)分離的目的，因此在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平衡離子能與樣品中的組分離子進(jìn)行有效的交換。如果平衡離子與離子交換劑結(jié)合力過(guò)強(qiáng)，會(huì)造成組分離子難以與交換劑結(jié)合而使交換容量降低。另外還要保證平衡離子不對(duì)樣品組分有明顯影響。四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存②39四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存②再生：因?yàn)樵诜蛛x過(guò)程中，平衡離子被置換到流動(dòng)相中，它不能對(duì)樣品組分有污染或破壞。如在制備過(guò)程中用到的離子交換劑的平衡離子是H或OH離子，因?yàn)槠渌x子都會(huì)對(duì)純水有污染。但是在分離蛋白質(zhì)時(shí)，一般不能使用H或OH型離子交換劑，因?yàn)榉蛛x過(guò)程中H或OH離子被置換出來(lái)都會(huì)改變層析柱內(nèi)pH值，影響分離效果，甚至引起蛋白質(zhì)的變性。四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存②40四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存③保存：離子交換劑保存時(shí)應(yīng)首先處理洗凈蛋白等雜質(zhì)，并加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎话慵尤?.02%的疊氮鈉，4℃下保存?，F(xiàn)在生產(chǎn)用層析介質(zhì)一般保存在10mMNaOH或20%的乙醇溶液中，或是二者的混合溶液中。四、離子交換劑的選擇、處理和保存2.離子交換劑的處理和保存③41四、離子交換層析的基本操作離子交換層析在生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)中的使用從前至后可分為如下操作步驟：1、裝柱2、前處理3、平衡4、上樣5、沖柱6、洗脫7、樣品收集8、后處理9、封柱四、離子交換層析的基本操作離子交換層析在生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)中的使用從42四、離子交換層析的基本操作

1、裝柱離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過(guò)長(zhǎng)；層析柱選柱過(guò)程中也必須考慮層析柱高度，過(guò)短+流速過(guò)快可能會(huì)出現(xiàn)蛋白未結(jié)合到介質(zhì)上就已經(jīng)流穿出來(lái)現(xiàn)象。層析柱安裝要垂直。裝柱時(shí)要均勻平整，不能有氣泡。四、離子交換層析的基本操作

1、裝柱離子交換層析要根據(jù)分離43四、離子交換層析的基本操作

2、前處理也層析介質(zhì)再生的一個(gè)過(guò)程，是用高濃度的堿鹽將層析介質(zhì)上原掛有的離子（全）置換下來(lái)，使之均勻掛上平衡過(guò)程中能被置換的離子；再生的手段-尤其是弱陰離子和弱陽(yáng)離子一般采用的1M的NaCl溶液進(jìn)行再生，再生的溶液體積不應(yīng)小于層析柱的柱床體積；四、離子交換層析的基本操作

2、前處理也層析介質(zhì)再生的一個(gè)44四、離子交換層析的基本操作

2、前處理在生產(chǎn)中，一般采用的是1MNaOH-1MNaCl混合溶液進(jìn)行再生，再生的溶液體積一般在1~2個(gè)柱床體積。這是因?yàn)樵谏a(chǎn)中，層析柱的前處理除了是介質(zhì)的再生外，還是層析柱清潔的一個(gè)過(guò)程。生產(chǎn)中，NaCl是用來(lái)介質(zhì)再生的；NaOH則是層析柱清潔用的，尤其是去除層析柱中殘留的熱源類(lèi)物質(zhì)（細(xì)菌內(nèi)毒素）。四、離子交換層析的基本操作

2、前處理在生產(chǎn)中，一般采用的45四、離子交換層析的基本操作

3、平衡離子交換層析的基本反應(yīng)過(guò)程就是離子交換劑平衡離子與待分離物質(zhì)、緩沖液中離子間的交換，所以在離子交換層析中平衡緩沖液和洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的選擇對(duì)于分離效果有很大的影響。平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的選擇首先要保證各個(gè)待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。四、離子交換層析的基本操作

3、平衡離子交換層析的基本反應(yīng)46四、離子交換層析的基本操作

3、平衡其次是要使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。一般是使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合。而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定。在一些情況下（如污水處理）可以使雜質(zhì)與離子交換劑有牢固的結(jié)合，而樣品與離子交換劑結(jié)合不穩(wěn)定，也可以達(dá)到分離的目的。另外注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。選擇合適的平衡緩沖液，直接就可以去除大量的雜質(zhì)。并使得后面的洗脫有很好的效果。如果平衡緩沖液選擇不合適，可能會(huì)對(duì)后面的洗脫帶來(lái)困難，無(wú)法得到好的分離效果。四、離子交換層析的基本操作

3、平衡其次是要使各個(gè)待分離物47四、離子交換層析的基本操作

3、平衡在生產(chǎn)中，一般采用的是緩沖溶液+保護(hù)劑的模式作為平衡體系。分離純化中常用的平衡體系有TE緩沖體系、Ac緩沖體系、PB緩沖體系和碳酸緩沖體系等；常用的保護(hù)劑有EDTA及吐溫系列等。生產(chǎn)中為了達(dá)到較好的平衡效果，在平衡前經(jīng)常加一預(yù)平衡過(guò)程，采用的是較高濃度的緩沖體系沖一柱床體積，目的是為了較快的將層析柱上的酸堿離子置換下來(lái)。四、離子交換層析的基本操作

3、平衡在生產(chǎn)中，一般采用的是48四、離子交換層析的基本操作

4、上樣離子交換層析的上樣前應(yīng)檢測(cè)樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，并根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)樣品的離子強(qiáng)度和pH值。一般來(lái)說(shuō)，樣品的pH值應(yīng)與緩沖體系的pH相當(dāng)，上下不超過(guò)0.5為宜；離子強(qiáng)度需根據(jù)上樣樣品的具體情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。上樣樣品的介質(zhì)載量可以根據(jù)介質(zhì)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行模擬計(jì)算，一般情況下要低于說(shuō)明書(shū)標(biāo)示，具體情況依舊需要在生產(chǎn)中進(jìn)行摸索確定。四、離子交換層析的基本操作

4、上樣離子交換層析的上樣前應(yīng)49四、離子交換層析的基本操作

5、沖柱為離子柱操作中上樣與洗脫銜接的一道操作步驟，其目的有兩種：一是為樣品上柱與洗脫之間做一緩沖，避免出現(xiàn)樣品尚未與介質(zhì)結(jié)合，就被洗脫下來(lái)的情況；二是為建立洗脫基線，為之后的洗脫做一參考基準(zhǔn)。沖柱溶液即為平衡緩沖液，一般沖柱體積在1~2個(gè)床體積即可。四、離子交換層析的基本操作

5、沖柱為離子柱操作中上樣與洗50四、離子交換層析的基本操作

6、洗脫是層析的核心所在。在離子交換層析中一般常用梯度洗脫，通常有改變離子強(qiáng)度和改變pH兩種方式。改變離子強(qiáng)度通常是在洗脫過(guò)程中逐步增大離子強(qiáng)度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個(gè)組分被洗脫下來(lái)；而改變pH的洗脫，對(duì)于陽(yáng)離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。四、離子交換層析的基本操作

6、洗脫是層析的核心所在。51四、離子交換層析的基本操作

6、洗脫洗脫液的選擇首先也是要保證在整個(gè)洗脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次是要使結(jié)合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內(nèi)都能夠被洗脫下來(lái)。另外可以使梯度范圍盡量小一些，以提高分辨率。四、離子交換層析的基本操作

6、洗脫洗脫液的選擇首先也是要52四、離子交換層析的基本操作

6、洗脫洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來(lái)說(shuō)洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過(guò)慢會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來(lái)提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過(guò)寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。四、離子交換層析的基本操作

6、洗脫洗脫液的流速也會(huì)影響離53四、離子交換層析的基本操作

7、樣品收集樣品收集與洗脫相互應(yīng)，每一梯度洗脫都至少伴隨一梯度的收集。在標(biāo)準(zhǔn)洗脫峰形下，樣品收集可按前中后三峰進(jìn)行收集，樣品收集數(shù)量一般為3、5、6個(gè)樣品；若非標(biāo)準(zhǔn)峰形，樣品收集則需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行收集。四、離子交換層析的基本操作

7、樣品收集樣品收集與洗脫相互應(yīng)54四、離子交換層析的基本操作

8、后處理與前處理相對(duì)應(yīng)，操作方法也同前處理一致。每次層析結(jié)束后，均需對(duì)層析柱進(jìn)行后處理，這不僅適用于離子交換層析，也適用于其它類(lèi)型的層析介質(zhì)。四、離子交換層析的基本操作

8、后處理與前處理相對(duì)應(yīng)，操作55四、離子交換層析的基本操作

9、封柱生產(chǎn)結(jié)束后，若短時(shí)間內(nèi)不進(jìn)行下次的生產(chǎn)，該層析柱要閑置保存，需封柱后方可保存起來(lái)。常用的封柱液有10mM的NaOH、20%乙醇和0.1%的疊氮鈉。四、離子交換層析的基本操作

9、封柱生產(chǎn)結(jié)束后，若短時(shí)間內(nèi)不56四、離子交換層析的基本操作除了幾次的水沖外，上述即為離子交換層析的一套基本流程，在連續(xù)的生產(chǎn)中，一般很少涉及到裝柱和封柱操作步驟，前處理和后處理也基本只保留一次。了解層析柱的基本流程簡(jiǎn)單，想做好卻是不易，想做精就更難了，除了大量的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)外，還需要掌握層析柱的相關(guān)知識(shí)、蛋白質(zhì)的一般性質(zhì)、目的蛋白的性質(zhì)及主要雜質(zhì)蛋白的層析性質(zhì)，這些著實(shí)需要定下心來(lái)踏踏實(shí)實(shí)的做好每一項(xiàng)相關(guān)的工作。四、離子交換層析的基本操作除了幾次的水沖外，上述即為離子交換57五、離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析的應(yīng)用范圍很廣，主要有以下幾個(gè)方面：1.水處理2.分離純化小分子物質(zhì)3.分離純化生物大分子物質(zhì)五、離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析的應(yīng)用范圍很廣，主要有以下58五、離子交換層析的應(yīng)用

1.水處理離子交換層析是一種簡(jiǎn)單而有效的去除水中的雜質(zhì)及各種離子的方法，聚苯乙烯樹(shù)脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。純水的制備可以用蒸餾的方法，但要消耗大量的能源，而且制備量小、速度慢，也得不到高純度。用離子交換層析方法可以大量、快速制備高純水。一般是將水依次通過(guò)H+型強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑，去除各種陽(yáng)離子及與陽(yáng)離子交換劑吸附的雜質(zhì)；再通過(guò)OH-型強(qiáng)陰離子交換劑，去除各種陰離子及與陰離子交換劑吸附的雜質(zhì)，即可得到純水。再通過(guò)弱型陽(yáng)離子和陰離子交換劑進(jìn)一步純化，就可以得到純度較高的純水。離子交換劑使用一段時(shí)間后可以通過(guò)再生處理重復(fù)使用。五、離子交換層析的應(yīng)用

1.水處理離子交換層析是一種簡(jiǎn)單而59五、離子交換層析的應(yīng)用

2.分離純化小分子物質(zhì)離子交換層析也廣泛的應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。例如對(duì)氨基酸的分析，使用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子聚苯乙烯樹(shù)脂，將氨基酸混合液在pH2~3上柱。這時(shí)氨基酸都結(jié)合在樹(shù)脂上，再逐步提高洗脫液的的離子強(qiáng)度和pH，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來(lái)，可以進(jìn)行分離鑒定。目前已有全部自動(dòng)的氨基酸分析儀。五、離子交換層析的應(yīng)用

2.分離純化小分子物質(zhì)離子交換層析60五、離子交換層析的應(yīng)用

3.分離純化生物大分子物質(zhì)離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來(lái)進(jìn)行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。由于生物樣品中蛋白的復(fù)雜性，一般很難只經(jīng)過(guò)一次離子交換層析就達(dá)到高純度，往往要與其它分離方法配合使用。使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來(lái)分離的特性，只要選擇合適的條件，通過(guò)離子交換層析可以得