牙齦卟啉單胞菌合成環(huán)二腺苷酸的高效液相色譜

牙齦卟啉單胞菌合成環(huán)二腺苷酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性分析譚詠梅;楊小軍;杜娟;趙望泓;陳曉丹;侯晉【摘要】目的：定性檢測牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)是否能產(chǎn)生細(xì)菌信號分子環(huán)二腺苷酸(c-di-AMP)，為探索其在P.gingivalis生命代謝以及牙周炎免疫中的作用奠定基礎(chǔ)。方法以P.gingivalis標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33277為實驗菌株，抽提細(xì)菌內(nèi)核酸物質(zhì)作為樣品，配置c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)和高效液相色譜法(HPLC)對樣品進(jìn)行驗證。結(jié)果HPLC-MS/MS檢出限按照信噪比(S/N)3:1計算，c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間為7.49min,P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82min時有目標(biāo)峰出現(xiàn)(大于3S/N)。HPLC檢測結(jié)果表明，P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品均在15.7min處出現(xiàn)目標(biāo)峰，且二者的紫外吸收光譜相同。結(jié)論牙齦卟啉單胞菌核酸提取物中含有c-di-AMP，牙齦卟啉單胞菌可以合成產(chǎn)生c-di-AMP。％ObjectiveTotestwhetherPorphyromonasgingivalis(P.gingivalis)couldproducebacterialsignalmolecule,bis-(3'-5')-cyclicdimericadenosinemonophosphate(c-di-AMP)andlaythefoundationforexplorationsofitsrolesinlifemetabolismandperiodontitisimmunityofP.gingivalis.MethodsP.gingivalisstandardstrainATCC33277wasusedastheexperimentalstraintoextractnucleicacidsfromthebacteria.Then,c-di-AMPwasdetectedusinghighperformanceliquidchromatographycoupledwithmassspectrometry(HPLC-MS/MS).Subsequently,HPLCwasusedtovalidatethesamplefurther.ResultsBasedonthesignal/noise(S/N)for3:1,thelimitofdeterminationofHPLC-MS/MSforpeaktimeofc-di-AMPstandardsubstanceswas7.49minandnucleicacidextractionsfromP.gingivaliswas8.82min(S/N>3).FurtherconfirmationofHPLCshowedthatnucleicacidextractionsfrombothP.gingivalisandc-di-AMPstandardsubstancespresentedgoalabsorbentpeaksat15.7min,withthesameultravioletabsorbentspectrum.ConclusionThenucleicacidextractionsfromP.gingivaliscontainedc-di-AMP,whichshowsthatP.gingivaliscouldproducec-di-AMP.【期刊名稱】《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》年(卷),期】2016(034)003【總頁數(shù)】5頁(P307-311)【關(guān)鍵詞】環(huán)二腺苷酸;牙齦卟啉單胞菌;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法【作者】譚詠梅;楊小軍;杜娟;趙望泓;陳曉丹;侯晉【作者單位】南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科;南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科;南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院衛(wèi)生監(jiān)測中心，廣州510515;南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科;汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科，汕頭515041;南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科【正文語種】中文【中圖分類】R780.2Supportedby:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81500870);PresidentFoundationofNanfangHospital,SouthernMedicalUniversity(2013Z006,2012C005).Correspondence:HouJin,E-mail:.cn.環(huán)二鳥苷酸［bis-(3'-5')-cyclicdimericguano-sinemonophosphate,c-di-GMP］和環(huán)二腺苷酸［bis-(3'-5')-cyclicdimericadenosinemonophosphate，c-di-AMP］是近年來新發(fā)現(xiàn)的，在細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在的信號分子［1-2］。目前的研究結(jié)果顯示，c-di-GMP作為第二信使，在細(xì)菌的蠕動、毒力因子的表達(dá)、生物膜的形成、細(xì)胞周期、細(xì)胞間通訊以及細(xì)菌對宿主細(xì)胞的入侵等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，是細(xì)菌生存和代謝的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一［3-5］。與c-di-GMP相比，c-di-AMP的發(fā)現(xiàn)較晚，研究相對較少，因此對其功能了解十分有限?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，c-di-AMP與細(xì)菌肽聚糖穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞耐藥性、細(xì)菌大小、生物膜形成、肺炎鏈球菌菌鏈的長度以及細(xì)菌感染有著密切的關(guān)系，并且其在不同的菌種中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)功能［6］。c-di-AMP是通過二腺苷酸環(huán)化酶(diadenylatecyclase，DAC)由兩分子的ATP或ADP合成而來，而其降解代謝與c-di-GMP-樣都是通過磷酸二酯酶來完成。2008年Witte等［7］在研究細(xì)菌的Checkpoint蛋白DisA的過程中發(fā)現(xiàn)，該蛋白結(jié)構(gòu)中有一個未知功能的結(jié)構(gòu)域147(domainofunknownfunction147,DUF147)，其具有二腺苷酸環(huán)化酶的活性，能將兩分子的ATP合成一分子的環(huán)二磷酸腺苷，因此該結(jié)構(gòu)域又被命名為DAC結(jié)構(gòu)域。由于該結(jié)構(gòu)域多耦聯(lián)于DisA蛋白中，并且位于DisA蛋白的氨基端，所以又被稱為DisA_N結(jié)構(gòu)域。Pfam數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)顯示，11352個物種中都含有DisA_N結(jié)構(gòu)域。說明c-di-AMP這個信號分子在細(xì)菌中廣泛存在。通過常規(guī)的生物學(xué)方法敲除c-di-AMP的合成蛋白基因會導(dǎo)致多種細(xì)菌死亡，提示c-di-AMP在細(xì)菌的生命代謝過程中發(fā)揮著重要作用，是細(xì)菌生長所必需的信號分子。除此之外，c-di-AMP還可以作為病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)被宿主細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體(patternrecognitionreceptors,PRRs)特異性識別，激活宿主的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)［2］。雖然研究者已經(jīng)在枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis）［8］、李斯特菌（Listeriamonocytogenes）［9］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［10］以及乳酸球菌（Lactococcuslactis）［11］等細(xì)菌的核酸提取物中檢測到了c-di-AMP的存在，但有關(guān)牙周炎致病菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis）中c-di-AMP的研究迄今為止未見報道。本研究的目的是通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（highperformanceliquidchromatographycoupledwithmassspectrometry，HPLC-MS/MS）和高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）定性檢測P.gingivalis是否能產(chǎn)生細(xì)菌信號分子c-di-AMP，為探索c-di-AMP在P.gingivalis生命代謝以及牙周炎免疫中的作用奠定基礎(chǔ)。實驗細(xì)菌P.gingivalisATCC33277菌株購自美國Microbiologics公司。主要試劑及儀器胰酶大豆肉湯（TrypticSoyBroth，TSB）培養(yǎng)基、L-鹽酸半胱氨酸、氯化血紅素、維生素K3（Sigma公司，美國），無菌脫纖維綿羊血（廣州蕊特生物科技有限公司），c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品（Invivogen公司，美國），色譜純甲醇、乙腈（Merck公司，德國）。AnoxomatMark口厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)（MART公司，荷蘭），電子天平（Sartorius公司，德國），正置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本），生物安全柜（上海振陽設(shè)備有限公司），離心機(jī)（Therm。公司，美國），AB4000液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（MDSSciex公司，美國），氮吹儀（Organomation公司，美國），API4000QTrapHPLC-MS/MS聯(lián)用儀配有Agilent1200高效液相色譜（AgilentTechnologies公司，美國），Shim-packXR-ODS色譜柱（島津公司，日本），PhenomenexC-18色譜柱（Phenomenex公司，美國）。1.3細(xì)菌培養(yǎng)將P.gingivalisATCC33277復(fù)蘇后接種于TSB血瓊脂培養(yǎng)基（含50mL?L-1凍溶羊血、0.5g?L-1L-鹽酸半胱氨酸、5mg?L-1氯化血紅素和1mg?L-1維生素K3）,37°C厭氧培養(yǎng)（80%N2、10%CO2、10%H2）。樣品的提取與純化樣品提取的方法參考文獻(xiàn)［12-13］。取5mL對數(shù)生長期（OD6905.8）的細(xì)菌菌液，4C、2500g離心20min，棄上清，加入1mL的培養(yǎng)基重懸細(xì)菌沉淀物，4C、2500g離心20min，棄上清，往沉淀中加入300pL的提取液（乙腈：甲醇：水=2:2:1）,冰上孵育15min，放入95C加熱10min后立即在冰上冷卻，4C、20800g離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到另一支2mL的離心管中。再往細(xì)菌沉淀物中加入200pL的提取液，冰上孵育15min,4C,20800g離心10min，收集上清（該步驟重復(fù)2次）。將所獲得的上清-20C冷凍過夜。次日，4C、20800g離心10min，收集上清。將獲得的核酸提取物樣品在氮氣流中吹干，用甲醇復(fù)溶，上機(jī)檢測。c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制在c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品中加入1mL色譜級甲醇，溶解，混勻，配置成1mg?mL-1的儲存液。將標(biāo)準(zhǔn)品儲存液用色譜級水稀釋，配成10ng?mL-1和100ng?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。HPLC-MS/MS檢測采用HPLC-MS/MS檢測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品。1）環(huán)境條件：溫度15~30C,相對濕度小于等于80%。2）色譜條件。色譜柱：島津Shim-packXR-ODS（75mmx2.0mm）;流動相：甲醇作為有機(jī)相，10mmol丄-1的醋酸銨加0.1%醋酸作為水相；流速：0.3mL?min-1;柱溫：室溫；進(jìn)樣量：5pL。質(zhì)譜條件見表;離子源為ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測(multiplereactionmonitoring，MRM)掃描模式，噴霧電壓為5500V,離子源溫度350°C,氣簾氣15.0kPa，離子源氣體12.0kPa。HPLC檢測采用HPLC對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步驗證。1)環(huán)境條件。溫度：15~30C,相對濕度小于等于80%。2)色譜條件。色譜柱：PhenomenexC-18(150mmx4.60mm)；體系：采用A和B雙泵系統(tǒng)，流動相A相為10%乙腈+0.1%甲酸，B相為90%乙腈；流量：1.000mL?min-1;低壓限值：0.00bar;高壓限值：400.00bar;梯度洗脫程序：0~20min,A:20.0%,B:80.0%；21-24min,A:0.0%B:100.0%;25-30min,A：95.0%,B:5.0%。柱溫：室溫；進(jìn)樣量：30.00U。HPLC結(jié)果以保留時間和紫外吸收光譜定性，即通過將c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間與P.gingivalis核酸提取樣品進(jìn)行比對，再結(jié)合相應(yīng)的光譜曲線,對樣品進(jìn)行定性分析。2.1生物信息學(xué)檢索通過生物信息檢索發(fā)現(xiàn)，在已知基因序列的P.gingivalis菌株中具有腺苷酸環(huán)化酶活性的DisA_N結(jié)構(gòu)域(表2)。已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA均包含255個氨基酸。在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)中對已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，ATCC33277、TDC60和F0569的DisA蛋白具有完全相同的氨基酸序列，而其余8個菌株的DisA的氨基酸序列完全相同(表)。氨基酸序列之間的相似性為99%,兩者之間只是羧基末端的第252位氨基酸不同，但DisA_N結(jié)構(gòu)域的區(qū)域為8~249位氨基酸，因此該差異氨基酸并不位于DisA_N結(jié)構(gòu)域內(nèi)。HPLC-MS/MS檢測HPLC-MS/MS檢測結(jié)果見圖1。HPLC-MS/MS檢出限按照信噪比（S/N）3:1計算，c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間為7.49min，P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82min時有目標(biāo)峰出現(xiàn)（大于3S/N），而且提取物中含有與標(biāo)準(zhǔn)品分子量一致的物質(zhì)。這表明，P.gingivalis的菌體核酸提取物中含有c-di-AMP。HPLC檢測HPLC檢測結(jié)果見圖2。P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品均在min處出現(xiàn)目標(biāo)峰，且二者的紫外吸收光譜相同。這表明，樣品中含有與標(biāo)準(zhǔn)品為同一物質(zhì)的c-di-AMP。c-di-AMP是細(xì)菌中廣泛存在的環(huán)二核苷酸（cyclicdinucleotides，CDNs）信號分子，由兩分子的ATP或ADP在二腺苷酸環(huán)化酶的作用下合成而來。Pfam數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)顯示，11352個物種中的12702種蛋白都含有具有二腺苷酸環(huán)化酶活性的DAC結(jié)構(gòu)域即DisA_N結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域常常與其他功能的結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)在—起，而且不同功能結(jié)構(gòu)域的組合方式已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有21種之多，如DNA結(jié)合功能域、跨膜信號肽、PAS功能域、蛋白激酶功能域、磷酸化功能域以及功能未知的蛋白功能域等，說明c-di-AMP在細(xì)菌的生命代謝過程中扮演著多重角色。本研究通過生物信息檢索發(fā)現(xiàn)在已知基因序列的牙齦卟啉單胞菌的菌株中皆存在DisA_N結(jié)構(gòu)域，該結(jié)果表明牙周致病菌P.gingivalis可能會合成和分泌c-di-AMP。本研究以P.gingivalis標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33277為實驗菌株，通過HPLC-MS/MS定性檢測P.gingivalis菌體提取物中是否存在c-di-AMP。實驗結(jié)果顯示，檢出限按照信噪比（S/N）3：1計算，濃度為10ng?mL-1的c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間為7.49min,P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82min時有目標(biāo)峰出現(xiàn)（大于3S/N）。因此，考慮P.gingivalis核酸提取物中可能含有c-di-AMP。由于樣品與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間的差異，筆者采用HPLC法對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。本研究采用乙腈和甲酸對樣品進(jìn)行等梯度洗脫，HPLC結(jié)果以保留時間和紫外吸收光譜定性，即通過將P.gingivalis核酸提取樣品的保留時間與c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對，再結(jié)合相應(yīng)的光譜曲線，對該樣品進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示：P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品均在15.7min處出現(xiàn)目標(biāo)峰，而且樣品與標(biāo)準(zhǔn)品峰的紫外吸收光譜相同，因此，可以認(rèn)為P.gingivalis核酸提取物中含有c-di-AMP，即P.gingivalis可以合成和分泌c-di-AMP。色質(zhì)聯(lián)用法在檢測分析過程中還存在色譜條件優(yōu)化的問題，在本研究中，c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品及牙齦卟啉單胞菌核酸提取物樣品兩者出峰時間不同，可能是受到了基質(zhì)干擾、流動相、色譜柱以及實驗環(huán)境等多方面的影響，檢測條件還需進(jìn)一步優(yōu)化。c-di-AMP作為細(xì)菌重要的信號分子，研究顯示：過量的c-di-AMP可干擾枯草芽抱桿菌肽聚糖的合成［8］；在金黃色葡萄球菌和乳酸球菌中，菌胞內(nèi)cdi-AMP水平的升高可幫助細(xì)菌適應(yīng)極端環(huán)境［10-11］，而且菌胞內(nèi)c-di-AMP水平的升高有助于金黃色葡萄球菌的生長和分裂，這表明其在細(xì)菌的生命代謝過程中發(fā)揮著重要作用。c-di-AMP除了在細(xì)菌的生命代謝過程中扮演第二信使的角色外，還可被細(xì)胞內(nèi)的某些DNA受體類的PRRs識別，調(diào)節(jié)干擾素(interferon)叩介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的活性，引發(fā)宿主的固有免疫反應(yīng)［14-17］。入侵到宿主細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌所產(chǎn)生的c-di-AMP可以被宿主細(xì)胞胞漿內(nèi)的一類PRRs所感知，并激活宿主細(xì)胞的I型干擾素反應(yīng)［9］。本研究證明了牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌可合成c-di-AMP，但是c-di-AMP在其生命代謝中的作用，以及入侵到宿主細(xì)胞內(nèi)的P.gingivalis所產(chǎn)生的c-di-AMP是否能激活宿主的I型干擾素反應(yīng)，并在牙周炎的免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮作用，還有待于進(jìn)一步的深入研究。相關(guān)文獻(xiàn)】RyjenkovDA,TarutinaM,MoskvinOV,etal.Cyclicdiguanylateisaubiquitoussignalingmoleculeinbacteria:insightsintobiochemistryoftheGGDEFproteindomain[J].JBacteriol,2005,187(5):1792-1798.RomlingU.Greattimesforsmallmolecules:c-di-AMP,asecondmessengercandidateinBacteriaandArchaea[J].SciSignal,2008,1(33):e39.SchirmerT,JenalU.Structuralandmechanisticdeterminantsofc-di-GMPsignalling[J].NatRevMicrobiol,2009,7(10):724-735.MillsE,PultzIS,KulasekaraHD,etal.Thebacterialsecondmessengerc-di-GMP:mechanismsofsignalling[J].CellMicrobiol,2011,13(8):1122-1129.PovolotskyTL,HenggeR.‘Life-style'controlnetworksinEscherichiacoli:signalingbythesecondmessengerc-di-GMP[J].JBiotechnol,2012,160(1/2):10-16.CorriganRM,GrUndlingA.Cyclicdi-AMP:anothersecondmessengerentersthefray[J].NatRevMicrobiol,2013,11(8):513-524.WitteG,HartungS,BUttnerK,etal.StructuralbiochemistryofabacterialcheckpointproteinrevealsdiadenylatecyclaseactivityregulatedbyDNArecombinationintermediates[J].MolCell,2008,30(2):167-178.MehneFM,GunkaK,EilersH,etal.Cyclicdi-AMPhomeostasisinbacillussubtilis:bothlackandhighlevelaccumulationofthenucleotidearedetrimentalforcellgrowth[J].JBiol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