金屬-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研究進展

金屬-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研究進展

1細菌耐藥機制近年來，細菌對-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性逐漸成為臨床抗感染治療的主要威脅。其中-內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)是導(dǎo)致細菌耐藥性的主要機制之一。β-內(nèi)酰胺酶被分為A、B、C、D四類。其中A、C、D類依賴活性位點中的Ser殘基發(fā)揮水解活性,而B類依賴活性中心的金屬離子,故被稱為金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-β-lactamase,MBL)雖然越來越多的金屬酶抑制劑被報道2材料和方法2.1肽分子與nd-1的對接不少含有巰基的化合物已被報道對MBLs有較好的抑制活性,其中不乏基于氨基酸結(jié)構(gòu)設(shè)計的巰基衍生物然后用分子對接的方法模擬三肽分子與NDM-1的結(jié)合模式。對接過程在MOE2014中完成,NDM-1的晶體結(jié)構(gòu)取自PDB數(shù)據(jù)庫(PDBID:3Q6X)。首先對蛋白結(jié)構(gòu)加氫、質(zhì)子化,將結(jié)構(gòu)中的原有配體周圍口袋定義為活性位點。構(gòu)建三肽分子并進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化及質(zhì)子化處理,對接方法選擇ProxyTriangle,打分函數(shù)選擇LondondG。2.2ndm-1金屬酶的檢測和動力學參數(shù)的測量實驗室前期已構(gòu)建pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)的重組菌株,NDM-1的表達、純化方法參考文獻2.33.3醇對nd-1的抑制作用的測定2.3.1酶解時間的確定在吉爾生化(上海)有限公司合成三肽分子。依據(jù)NDM-1的動力學特點,我們選擇頭孢呋辛鈉作為報告底物,在260nm波長下測定其吸光度隨酶水解時間的變化,計算反應(yīng)初速度。反應(yīng)的緩沖液體系為含Zn2.3.2三醇分子與抗生素聯(lián)合抗菌活性的測定重組菌株pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)復(fù)蘇后挑取單菌落培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD3結(jié)果與討論3.1nd-1的純化及動力學參數(shù)實驗室前期已構(gòu)建好pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)的重組菌株(NDM-1的N端添加了His-tag以便后續(xù)純化),在20℃下誘導(dǎo)表達20h后收集菌體,經(jīng)超聲破碎后對上清中的NDM-1采用鎳柱親和層析法進行分離、純化,純化結(jié)果如圖2所示。以青霉素(氨芐西林)、頭孢菌素(頭孢呋辛、頭孢唑肟)及碳青霉烯類(美羅培南)抗生素為底物,測定NDM-1水解動力學參數(shù)見表1。結(jié)果顯示NDM-1對經(jīng)典青霉素類抗生素氨芐西林的水解速率(K3.2nd-1的相互作用NDM-1屬于B1類金屬β-內(nèi)酰胺酶,其活性位點處有兩個Zn離子,Zn1與H120–H122–H189(3H位點)配位,Zn2與D124–C208–H250(DCH位點)配位。氨芐西林及卡托普利與NDM-1的相互作用模式如圖3所示。氨芐西林的酰胺氧與Zn1配位,羧基氧與Zn2配位,卡托普利的巰基同時與兩個鋅離子配位,這是配體與NDM-1之間最重要的相互作用鍵。另外,氨芐西林還與NDM-1的Q123和E152形成氫鍵,卡托普利與N220形成氫鍵。通過分子對接方法研究三肽分子與NDM-1的相互作用。如圖3所示,含有半胱氨酸的三肽游離巰基均能與鋅離子發(fā)生配位,其中FCf、Fcf、FCp和Fcp的巰基同時與兩個鋅離子配位,而fCp和fcp上的巰基只與Zn2配位,其羧基Zn1配位。FCf、FCp和Fcp還與K211形成氫鍵,FCf、Fcf、Fcp和fcp與N220形成氫鍵,FCf還與Q123形成氫鍵。3.3三醇對nd-1的抑制作用3.3.1三醇對nd-1的抑制作用三肽分子對NDM-1的抑制活性IC3.3.2肽的抗菌活性三肽分子在終濃度為200μmol/L時與頭孢呋辛聯(lián)用對重組NDM-1大腸埃希菌的抑菌效果如表3所示。當頭孢呋辛濃度為0μmol/L時,6條三肽分子均不能抑制大腸埃希菌生長,說明三肽本身無抗菌活性;FCf與頭孢呋辛聯(lián)用的抑菌效果比較明顯,使頭孢呋辛對NDM-1重組菌的MIC由128μg/mL降低至32μg/mL,降低4倍;當半胱氨酸變?yōu)镈型時,Fcf與頭孢呋辛聯(lián)用的抑菌效果下降,MIC變?yōu)?4μg/mL;三肽C端D-Phe變成D-Pro或者N端L-Phe變成D-Phe時,與FCf相比,聯(lián)合抑菌效果均降低,其中fCp和fcp沒有使頭孢呋辛的MIC降低,說明無聯(lián)合抑菌效果。由此可見,聯(lián)合抑菌實驗結(jié)果與3.3.1中的IC4表面活性劑的設(shè)計及合成近年來,細菌耐藥性的發(fā)展使得金屬-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研發(fā)倍受關(guān)注,而多肽類抗生素的耐藥性發(fā)展相對較慢,且對臨床上多重耐藥菌的治療效果可觀,因此開發(fā)新型多肽類抗菌藥物具有重要的應(yīng)用價值。本文基于NDM-1的底物氨芐西林和抑制劑卡托普利的結(jié)構(gòu),通過理性設(shè)計得到6條含有Cys的三肽。相互作用模式分析發(fā)現(xiàn)它們的游離巰基均能與NDM-1的鋅離子配位,與卡托普利和NDM-1的關(guān)鍵作用模式類似。通過對NDM-1的抑