Promicol ATP微生物快速檢測系統(tǒng)在UHT滅菌奶商業(yè)無菌檢測上的應(yīng)用研究

PromicolATP微生物快速檢測系統(tǒng)在UHT滅菌奶商業(yè)無菌檢測上的應(yīng)用研究林木娣;黃詩韻;楊愛君;何瑛【摘要】介紹一種微生物快速檢測系統(tǒng)，利用活體微生物中的三磷酸腺苷(ATP)作為標(biāo)記分子，通過檢測超高溫(UHT)滅菌奶中微生物的ATP在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度,可以間接測定樣品中的微生物含量.該方法具有簡便、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)驗(yàn)證能與國標(biāo)法商業(yè)無菌檢測達(dá)到一樣的篩查檢驗(yàn)?zāi)康?能夠?qū)HT產(chǎn)品進(jìn)行快速放行，在UHT滅菌乳與乳制品的質(zhì)量監(jiān)控中具有重要的意義.期刊名稱】《中國乳業(yè)》年(卷),期】2017(000)006【總頁數(shù)】6頁(P69-74)【關(guān)鍵詞】三磷酸腺苷(ATP)；商業(yè)無菌檢測;超高溫(UHT)滅菌奶;快速檢測【作者】林木娣;黃詩韻;楊愛君;何瑛【作者單位】廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司;廣州中實(shí)生物科技有限公司;廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司;廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司【正文語種】中文(1廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司；2廣州中實(shí)生物科技有限公司)乳與乳制品是大家公認(rèn)的營養(yǎng)全面的食品，對改善居民的營養(yǎng)、平衡膳食結(jié)構(gòu)、補(bǔ)鈣和增強(qiáng)體質(zhì)均有重要的作用。超高溫(UHT)滅菌奶是其中的一種，因其保存方便、保質(zhì)期長的特點(diǎn)，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。按照國家安全標(biāo)準(zhǔn)的要求，所有經(jīng)過UHT滅菌的食品都需要經(jīng)過商業(yè)無菌檢驗(yàn)合格才能出售，因商業(yè)無菌的微生物檢驗(yàn)［1］需耗時(shí)10天以上，檢驗(yàn)周期長給企業(yè)的倉儲、資金回籠等帶來較大的壓力，越來越多的企業(yè)迫切需要一種可靠的、穩(wěn)定的、快速的微生物檢測方法來替代傳統(tǒng)的商業(yè)無菌檢驗(yàn)方法，從而達(dá)到快速篩查放行的目的，為搶占市場及內(nèi)部經(jīng)營提供便利。三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate，ATP）生物發(fā)光檢測方法具有簡便、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用在微生物檢測［2］、食品衛(wèi)生監(jiān)控［3］等領(lǐng)域，而歐洲、澳洲等地近年也致力于ATP微生物快速檢測系統(tǒng)在UHT滅菌奶的商業(yè)無菌檢驗(yàn)的研究及推廣。PromicolATP微生物快速檢測系統(tǒng)是利用ATP生物發(fā)光原理對產(chǎn)品中的微生物進(jìn)行檢測。本文從檢驗(yàn)的原理、方法、操作便利性、檢測所需時(shí)間、方法可靠性及穩(wěn)定性等方面進(jìn)行研究和評估。ATP生物發(fā)光檢測的原理ATP生物發(fā)光檢測的原理［4］基于以下兩點(diǎn)。（1）ATP作為活體微生物的標(biāo)記分子，存在于所有活細(xì)胞中，可以作為能量的直接提供者，而對于在一定生理時(shí)期內(nèi)的活體微生物，ATP濃度與活體微生物含量之間有良好的線性關(guān)系。（2）在自然界中，ATP可誘導(dǎo)生物發(fā)光系統(tǒng)發(fā)光，一個(gè)常見例子為螢火蟲尾部的熒光素/熒光素酶反應(yīng)，反應(yīng)機(jī)制如下：通過檢測ATP在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，可以間接測定樣品中的微生物含量ATP微生物快速檢測系統(tǒng)檢驗(yàn)方法試驗(yàn)使用PromiliteM4儀器（荷蘭Promicol）及UHT/ESL牛奶檢測試劑（荷蘭Promicol，貨號：399-4041201），Photonix?控制軟件分析。產(chǎn)品經(jīng)過48h整包保溫后，取適量樣品置于ATP微生物檢測系統(tǒng)內(nèi)，系統(tǒng)首先會使用Proase試劑（ATP雙磷酸酶）自動去除樣品中的非微生物ATP。然后微生物被Promex裂解劑裂解，其中的ATP被釋放，當(dāng)加入Prolux試劑（含熒光素/熒光素酶）后，儀器對樣品中的發(fā)光量進(jìn)行檢測，發(fā)光量換算為相對光子值（RelativeLightUnits，RLU）。無污染的樣品獲得低RLU結(jié)果，而污染樣品的RLU值則比干凈樣品高出3倍或以上。驗(yàn)證包括空白值的確認(rèn)、目標(biāo)菌（蠟樣芽飽桿菌）污染試驗(yàn)及生產(chǎn)過程中受到微生物污染而出現(xiàn)壞包的樣品試驗(yàn)，基本覆蓋了UHT滅菌奶生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的微生物污染情況。2.1樣品ATP空白值確認(rèn)空白值即陰性（或無菌）樣品的RLU值。為了能夠靈敏地檢測出污染樣品中低水平微生物的ATP，選用的試劑需要有效地去除UHT滅菌奶樣品中可能存在的非微生物ATP（體細(xì)胞ATP或游離ATP），得到盡可能低并可重復(fù)獲得的空白值。確定空白值后，判定各種樣品合格與否的具體標(biāo)準(zhǔn)如下。（1）若樣品RLU值低于2倍空白值，則該樣品為陰性。（2）若樣品RLU值在2~3倍空白值，則結(jié)果視為可疑，該樣品應(yīng)繼續(xù)保溫6h后重新檢測，若樣品為陽性樣，RLU值會大幅度上升。（3）若樣品RLU值大于3倍空白值，則該樣品為陽性。從每種UHT滅菌奶中選取10盒陰性樣品（最好來自不同批次）進(jìn)行保溫。保溫后每盒樣品均取4個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù)性檢測，取所有陰性結(jié)果平均值作為空白值。如有異常樣品，需排除此樣品的檢測結(jié)果。具體操作如下：將10盒樣品放置于36°C保溫48h，搖勻經(jīng)過保溫的樣品后，用酒精消毒包裝，并從每個(gè)樣品中分別吸取4x50pL到微孔板（無ATP）的4個(gè)孔中，PromiliteM4儀器自動完成整個(gè)“UHT/ESL樣品”程序，檢測結(jié)果以RLU表示。在進(jìn)行PromicolATP系統(tǒng)檢測的同時(shí)，取1mL樣品傾注平板，平板于36C培養(yǎng)48h。平板計(jì)數(shù)結(jié)果為陰性的樣品可以采用，結(jié)果為陽性的樣品需被排除。本試驗(yàn)測試了UHT滅菌純牛奶、UHT滅菌高鈣奶、UHT滅菌甜牛奶及UHT滅菌紅棗奶產(chǎn)品的空白值，并在控制軟件Photonix?中分別設(shè)置了上述產(chǎn)品合格與否的判定限值。蠟樣芽孢桿菌人工污染試驗(yàn)為了驗(yàn)證PromicolATP系統(tǒng)能否足夠靈敏地檢測出UHT滅菌奶中低濃度的微生物污染，在純牛奶中人為加入蠟樣芽孢桿菌（革蘭氏陽性代表菌，有芽孢）進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)前先使用LB液體培養(yǎng)基過夜復(fù)蘇蠟樣芽抱桿菌，然后使用無菌生理鹽水對菌株進(jìn)行10倍梯度稀釋（圖1）。分別將1mL的10-5、10-6、10-7和10-8稀釋度的菌液傾注平板，平板于36°C培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確定稀釋菌液的初始濃度；同時(shí)接種1mL該稀釋度菌液到樣品中，每個(gè)濃度的菌液稀釋液接種2個(gè)樣品，樣品封口并置于36C中保溫孵育48h。保溫孵育后，對樣品進(jìn)行ATP檢測。在無菌條件下，從每個(gè)接種菌液的樣品中吸出4x50pL置于4個(gè)微孔中，放入PromiliteM4后，儀器自動完成“UHT/ESL樣品”檢測程序（圖2）。在Photonix?軟件中，根據(jù)之前獲得的空白值，檢測結(jié)果自動解析成“合格”“可疑”及“不合格”。PromicolATP系統(tǒng)檢測后，將1mL樣品傾注平板，平板于36C培養(yǎng)48h。平板結(jié)果記錄為“生長（G）”或“沒生長（NG）”。自然陽性樣品分離菌株人工污染試驗(yàn)在生產(chǎn)過程中收集到的一個(gè)自然陽性樣品（壞包），用無菌取樣環(huán)取樣劃線，分離并獲得污染微生物的單個(gè)菌株后，按2.2的操作，人工污染合格批次的UHT純牛奶樣品，并進(jìn)行PromicolATP系統(tǒng)檢測和平板法檢測的對比驗(yàn)證。PromicolATP系統(tǒng)檢測與GB4789.26-2013商業(yè)無菌對照試驗(yàn)抽取UHT滅菌奶產(chǎn)品10盒，36°C保溫48h進(jìn)行PromicolATP系統(tǒng)檢測；另取相同時(shí)間段產(chǎn)品10盒按照GB4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無菌檢驗(yàn)》的要求進(jìn)行檢驗(yàn)。3.1樣品的ATP空白值選取3個(gè)批次共10個(gè)樣品的UHT滅菌純牛奶進(jìn)行試驗(yàn)。經(jīng)過36C保溫48h后，陰性樣品的空白ATP值檢測結(jié)果見表1。從表1可知，使用本次選用的試劑盒檢測純牛奶樣品，在36C保溫48h的條件下，均能獲得低的且可重復(fù)的空白值。同時(shí)，所有樣品對應(yīng)的平板檢測結(jié)果均為陰性，說明所選取的樣品ATP檢測結(jié)果均可采用。根據(jù)同樣操作，對UHT滅菌高鈣奶、UHT滅菌甜牛奶及UHT滅菌紅棗奶產(chǎn)品進(jìn)行空白值確認(rèn)，在空白值平均值的基礎(chǔ)上，可以確定各種產(chǎn)品ATP檢測的“合格”“可疑”和“不合格”限值（表2）。3.2蠟樣芽孢桿菌人工污染試驗(yàn)結(jié)果選取合格批次的UHT滅菌純牛奶樣品進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)2.2的操作，在樣品中接種不同濃度的蠟樣芽孢桿菌。人工污染的樣品代表實(shí)際過程中的不合格產(chǎn)品，對菌液稀釋液進(jìn)行平板檢測是為了確認(rèn)接種液的真實(shí)濃度（CFU/mL）。每個(gè)樣品接種1mL菌液稀釋液，每個(gè)稀釋度進(jìn)行2個(gè)樣品重復(fù)。進(jìn)行PromicolATP檢測時(shí)，每個(gè)樣品檢測4個(gè)重復(fù)，同時(shí)每個(gè)樣品均取1mL做平板法對照，結(jié)果記錄為“生長（G）”或“沒生長（NG）"。檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。從表3結(jié)果可知，接種了不同濃度的蠟樣芽抱桿菌的純牛奶樣品，經(jīng)過36C保溫48h后，ATP檢測能獲得高RLU值。其中，接種了10-7稀釋度菌液的樣品說明，即使樣品中的初始污染菌量為1CFU/mL，經(jīng)過保溫后，PromicolATP系統(tǒng)仍然能檢測出樣品陽性，表明PromicolATP系統(tǒng)具有很高的靈敏度。10-8稀釋度初始接種菌液平板獲得結(jié)果為0CFU/mL，而接種樣品保溫后檢測結(jié)果顯示一個(gè)為陽性、一個(gè)為陰性，表明在菌液原始濃度很低時(shí)，一個(gè)樣品接種到菌株，而另一個(gè)樣品并沒有接種到菌株。這兩個(gè)樣品保溫后分別取1mL用平板復(fù)檢，結(jié)果也對應(yīng)為—個(gè)陽性、一個(gè)陰性，ATP檢測結(jié)果與傳統(tǒng)平板法結(jié)果一致。自然陽性樣品分離菌株人工污染試驗(yàn)結(jié)果在樣品中接種不同濃度的自然陽性分離菌，模擬實(shí)際過程中受污染的產(chǎn)品。每個(gè)樣品接種1mL菌液稀釋液，每個(gè)稀釋度進(jìn)行2個(gè)樣品重復(fù)。進(jìn)行ATP檢測時(shí)，每個(gè)樣品檢測4個(gè)重復(fù)。PromicolATP方法檢測的同時(shí)，每個(gè)樣品均取1mL用平板法檢驗(yàn)，結(jié)果記錄為“生長（G）”或“沒生長（NG）"。檢驗(yàn)結(jié)果如表4。從表4結(jié)果可知，接種了不同濃度的自然陽性分離菌的純牛奶樣品，經(jīng)過36°C保溫48h后進(jìn)行ATP檢測，能獲得高RLU值。其中，接種了10-6稀釋度菌液的兩個(gè)樣品說明，即使樣品中的初始菌污染水平很低（v10CFU/mL），經(jīng)過保溫后，PromicolATP系統(tǒng)仍然能檢測出樣品陽性，表明PromicolATP系統(tǒng)具有很高的靈敏度。10-7稀釋度初始接種菌液平板獲得結(jié)果為0CFU/mL，而接種樣品保溫后，兩種方法的檢測結(jié)果均為一個(gè)陽性、一個(gè)陰性，表明在菌液原始濃度很低時(shí)，一個(gè)樣品接種了低濃度菌株，而一個(gè)樣品并沒有接種到菌株。此試驗(yàn)結(jié)果表明，ATP檢測結(jié)果與傳統(tǒng)平板法結(jié)果一致。PromicolATP系統(tǒng)檢測與GB4789.26-2013商業(yè)無菌對照試驗(yàn)結(jié)果抽取UHT滅菌高鈣奶10盒,36C保溫48h進(jìn)行ATP檢測，另抽取同批次相同時(shí)間段的產(chǎn)品10盒，按照GB4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無菌檢驗(yàn)》的要求操作，記錄感官、pH值及微生物變化，檢測結(jié)果如表5。從表5結(jié)果可知，國標(biāo)法檢驗(yàn)樣品感官正常，pH值與對照樣差異為0.06，無微生物增殖，符合商業(yè)無菌要求；采用PromicolATP系統(tǒng)檢驗(yàn)結(jié)果為合格，與國標(biāo)商業(yè)無菌檢驗(yàn)結(jié)果相符。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室UHT滅菌奶產(chǎn)品采取36°C保溫48h檢驗(yàn)菌落總數(shù)與36°C保溫7天測pH值相結(jié)合，并輔以部分商業(yè)無菌檢驗(yàn)的模式，在以上驗(yàn)證試驗(yàn)獲得預(yù)期結(jié)果的情況下，部分產(chǎn)品進(jìn)行PromicolATP系統(tǒng)快速放行，同時(shí)與當(dāng)前檢驗(yàn)?zāi)Ｊ綄φ?，結(jié)果如表6。由表6可見，PromicolATP系統(tǒng)檢驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法的結(jié)果一致，可以替代傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法用于UHT滅菌奶的快速放行。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，使用PromicolATP系統(tǒng)進(jìn)行UHT滅菌奶商業(yè)無菌快速檢測，所選的試劑及程序能有效去除樣品中的非微生物ATP，并獲得低且可重復(fù)的陰性空白RLU值。蠟樣芽孢桿菌人工污染試驗(yàn)及自然陽性樣品分離菌株人工污染試驗(yàn)結(jié)果均表明，PromicolATP檢測方法靈敏度高，且檢測結(jié)果與平板法檢測結(jié)果一致，能檢測出日常生產(chǎn)中有可能污染產(chǎn)品的微生物。5.3與國標(biāo)法商業(yè)無菌檢驗(yàn)對照試驗(yàn)結(jié)果及后續(xù)使用情況表明，PromicolATP系統(tǒng)檢驗(yàn)結(jié)果與GB4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無菌檢驗(yàn)》相符。5.4驗(yàn)證過程可知，使用PromicolATP系統(tǒng)對UHT滅菌奶進(jìn)行檢測，約25min可完成96個(gè)樣品的檢測，且操作簡便，此方法可作為快速、便利的商業(yè)無菌檢驗(yàn)方法。根據(jù)滅菌乳相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，UHT滅菌奶放行的微生物要求需要符合商業(yè)無菌標(biāo)準(zhǔn)，執(zhí)行GB4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無菌檢驗(yàn)》，該方法操作相對繁瑣，且需要對產(chǎn)品進(jìn)行10天的保溫再進(jìn)行檢測。目前，乳品企業(yè)大多采用保溫5~7天后，平板培養(yǎng)2天的方法對產(chǎn)品進(jìn)行等同于商業(yè)無菌的檢測。所以，越來越多的乳品企業(yè)傾向選擇可靠、穩(wěn)定的微生物快速檢測方法，作為產(chǎn)品快速放行的快篩手段。采用PromicolATP微生物快速檢測系統(tǒng)，乳品企業(yè)對產(chǎn)出樣品進(jìn)行36°C保溫48h后快速檢測，能在2.5~3天內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品放行，且結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡便，大大提高工作效率，縮短UHT滅菌奶的檢驗(yàn)時(shí)間，加強(qiáng)企業(yè)的市場競爭力，加速企業(yè)資金回流，對乳品企業(yè)質(zhì)量控制的發(fā)展具有重要意義，在其它UHT產(chǎn)品（如飲料）上也有廣闊的應(yīng)用前景。林木娣（1982-），女，大學(xué)本科，廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司品控中心食品助理工程師，主管微生物檢驗(yàn)和原材料驗(yàn)收工作?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.GB