假酸漿毛狀根黃酮提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性研究

假酸漿毛狀根黃酮提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性研究

張帥，呂宏佳，李婧菲，趙雪(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林吉林132101)0引言假酸漿又名草本酸木瓜，為茄科一年生草本植物，廣泛栽培在我國云南、廣西等地[1-2]。其全草入藥，主要功效有解毒、清熱退火、吐痰止咳等，可治療發(fā)熱、熱淋、癲癇、瘡癤等疾病[3-4]。毛狀根是由完整的植物或由植物中某一部分受到發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)侵染后所產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象[5]，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)出來的毛狀根中所含的次生代謝產(chǎn)物和自然生長的植物中有相同之處，更有些被誘導(dǎo)出的毛狀根所含有的次生代謝物成分超過原植物[6]。黃酮類化合物是植物的一種次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在自然界中，常用作抗菌劑、抗氧化劑和感光劑等，具有抗老化、調(diào)血脂、降血壓等保健功能，已成為醫(yī)藥和食品中天然抗氧化劑的開發(fā)目標[7-8]。但目前對毛狀根中黃酮的提取率普遍不高，提高毛狀根中黃酮的提取率是進行黃酮產(chǎn)品開發(fā)需要解決的問題。近些年，細菌的耐藥性現(xiàn)象日益嚴重，黃酮作為天然產(chǎn)物之一，其抗菌性能也備受關(guān)注[9]。分析了假酸漿植物誘導(dǎo)出的毛狀根中黃酮類化合提取工藝的優(yōu)化，并對其抑菌作用進行評價，為提取毛狀根中黃酮類化合物提供參考依據(jù)。1材料與方法1.1材料和試劑假酸漿無菌苗，假酸漿毛狀根，發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4。蘆丁標準品，Cef(頭孢噻肟鈉)溶液，氫氧化鈉，硝酸鋁，無水乙醇，98%濃硫酸，苯酚試劑，蒸餾水。1.2儀器設(shè)備電熱恒溫培養(yǎng)箱BPX-272，光照培養(yǎng)箱SPX-300B-G，超聲儀器KQ-400KDE，立式雙層智能精密型搖床BSD-YX(F)3200，單人單面垂直凈化工作臺VS-840-1，電子天平BSA124S-cw，UV-5100型紫外可見分光光度計。1.3實驗方法1.3.1假酸漿毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)取假酸漿無菌苗在無菌環(huán)境中剪下其莖段(1cm左右)放置于MS固體培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)2d。在無菌環(huán)境滅菌的錐形瓶中倒入活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，將預(yù)培養(yǎng)好的假酸漿莖段放置于菌液內(nèi)，侵染6min。取出被侵染的莖段，放置于無菌濾紙上，吸干表面上的菌液，將被侵染的莖段放置于MS固體培養(yǎng)基上，實行共培養(yǎng)4d。將共培養(yǎng)好的莖段取出，放置于(含有50mg/L青霉素)MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此后每6d轉(zhuǎn)接一次，直至長出毛狀根后逐漸降低培養(yǎng)基中抗生素濃度進行培養(yǎng)，培養(yǎng)到25d時統(tǒng)計毛狀根數(shù)量，在無菌環(huán)境中建立毛狀根離體培養(yǎng)體系。1.3.2液體培養(yǎng)基的篩選在無菌環(huán)境中，剪取0.2g(鮮重)毛狀根，分別放入含有20mLMS、White和N6(不含激素)的三種液體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)置為25℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為170r/min。避光培養(yǎng)，待生長6d、12d、18d、24d時測增殖數(shù)，篩選出最佳液體培養(yǎng)基。增長倍數(shù)=(收獲后鮮重-接種鮮重)/接種鮮重。1.3.3提取毛狀根總黃酮含量假酸漿毛狀根樣品的制備。將培養(yǎng)后的假酸漿毛狀根從液體培養(yǎng)基取出，用無菌水反復(fù)沖洗3次，后置于烘干箱低溫(40℃)烘干，用研缽將干燥的毛狀根研磨成粉末，密封保存?zhèn)溆?。毛狀根中黃酮的提取。準確稱取2g研磨后的假酸漿毛狀根粉末，以乙醇為溶劑，采取超聲提取法(功率為220W)提取毛狀根中的黃酮。標準品溶液的制備。稱取3mg蘆丁對照品置容量瓶中，加入濃度為70%乙醇30mL進行溶解。以濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。蘆丁標準品標準曲線的制備。用移液管分別吸取對照品溶液0.0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分別放入10mL容量瓶中，每個容量瓶內(nèi)加入0.4mL硝酸鈉、0.4mL硝酸鋁和4mL氫氧化鈉，用70%乙醇定容至刻度，混合搖勻，在510nm波長處測定吸光度，根據(jù)測出的吸光度值繪制標準曲線。結(jié)果計算得標準回歸方程Y=2.8229X-0.0019，R2=0.9991，在0.01～0.05mg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果如圖1所示。圖1蘆丁標準曲線Fig.1Standardcurveofrutin1.3.4單因素試驗乙醇濃度對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取干燥的毛狀根粉末2.0g，按1∶20料液比，用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇與毛狀根粉末混合作為提取液，提取溫度設(shè)置為50℃，超聲時間設(shè)置為30min，超聲波功率設(shè)置為220W，檢測黃酮提取率。提取溫度對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取研磨后毛狀根粉末2.0g，與70%乙醇溶液混勻，超聲功率220W，料液比為1∶20，提取時間30min，設(shè)置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的溫度進行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。料液比對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取研磨后毛狀根粉末2.0g，加入到裝有70%乙醇溶液的容量瓶中，超聲功率220W，溫度60℃，時間40min，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，進行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。提取時間對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取毛狀根粉末2.0g，與70%乙醇溶液混勻，220W超聲功率、60℃提取溫度，1∶20料液比，時間分別采用10min、20min、30min、40min、50min、60min進行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。1.3.5假酸漿毛狀根中黃酮抑菌作用研究超聲提取出的黃酮提取液稀釋成濃度分別為0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的溶液備用。采用紙片擴散法，準確吸取0.1mL在LB培養(yǎng)基中活化好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，將其分別接種在PDA培養(yǎng)皿中，用滅菌后的接菌針均勻涂布，密封后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48h。以1%頭孢曲松鈉為陽性對照，分別放入直徑5.0mm的無菌濾紙片浸泡，無菌水為陰性對照。將濾紙剪成直徑為1cm左右的小圓片，放置到5種不同濃度的黃酮溶液中浸泡，小濾紙片全部吸上液體后取出，把小濾紙片放置到供試菌株培養(yǎng)基表面，取3個濾紙片置于每個培養(yǎng)皿中，分別為頭孢曲松鈉(陽性對照)、陰性對照液和供試液，記好標識，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17h，取出培養(yǎng)皿，測抑菌圈直徑，作好記錄。2結(jié)果與分析2.1毛狀根增殖液體培養(yǎng)基的篩選結(jié)果由圖2可見，當毛狀根在MS液體培養(yǎng)基中生長，能促使其增殖量最多，其次培養(yǎng)基為N6，White培養(yǎng)基增殖量最少。當培養(yǎng)時間到24d時，毛狀根的增殖量最多，最高增殖量為接種量23.7倍。圖2培養(yǎng)基對毛狀根生長的影響Fig.2Effectofmediumonthegrowthofhairyroot2.2單因素對毛狀根中黃酮提取率的影響2.2.1乙醇濃度對毛狀根黃酮提取率的影響如圖3所示，當乙醇濃度范圍在50%～90%時，毛狀根中黃酮提取率先是逐漸增加，當達到最高量后開始出現(xiàn)下降趨勢，提取率最佳狀態(tài)是乙醇濃度為70%時，測得毛狀根中黃酮得率為8.2%。圖3乙醇濃度對黃酮提取得率的影響Fig.3Effectsofethanolconcentrationonextractionofflavones2.2.2提取溫度對毛狀根總黃酮提取率的影響如圖4所示，超聲浸提毛狀根中黃酮量，伴隨著溫度升高，黃酮含量呈先增后減趨勢，提取溫度升高到60℃時，毛狀根中黃酮的提取率最高，毛狀根中黃酮得率為7.8%。圖4提取溫度對黃酮提取得率的影響Fig.4Effectsoftemperatureonextractionrateofflavones2.2.3料液比對毛狀根中黃酮提取率的影響由于乙醇是揮發(fā)性溶劑，溶劑量的增加使黃酮被稀釋，黃酮在溶劑揮發(fā)過程中遭受損失，反而提高了雜質(zhì)成分的溶出。由圖5可知，隨著料液比例逐漸的增大，毛狀根中黃酮提取率呈現(xiàn)逐漸上升而后下降狀態(tài)，在料液比1∶20時，毛狀根中黃酮的提取率最高，毛狀根中黃酮得率為8.3%。圖5液料比對異黃酮提取得率的影響Fig.5Effectsofratioofliquidtosolidonextractionofflavones2.2.4提取時間對黃酮提取率的影響黃酮提取率還與提取時間有很大關(guān)系，時間太短沒能將黃酮類化合物提取出來，時間過長則易溶出其他雜質(zhì)。如圖6所示，毛狀根中黃酮得率隨著提取時間的增加而逐漸增高，當?shù)竭_40min后，呈現(xiàn)明顯下降趨勢，所以最佳提取時間為40min。圖6制取時間對黃酮提取得率的影響Fig.6Effectsofpreparationtimeonextractionyieldofflavonoids2.3假酸漿毛狀根中黃酮的抑菌效果如表1所示，毛狀根中提取出的黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，黃酮濃度在0.05%時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有起到作用；黃酮濃度在0.1%時，只對金黃色葡萄球菌起到抑菌作用；當黃酮濃度分別在1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL時，對以上兩種菌均有抑菌作用，且隨著黃酮的濃度增加，抑菌效果更明顯。表1不同濃度黃酮的抑菌效果Tab.1Antibacterialeffectsofdifferentconcentrationsofflavones3結(jié)論長期以來，人們不斷從植物中獲取大量的次生代謝產(chǎn)物應(yīng)于醫(yī)藥衛(wèi)生方面。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對使用由發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)出的假酸漿毛狀根中總黃酮的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果表明，利用超聲提取假酸漿毛