凝膠過濾色譜課件

凝膠過濾色譜填料第三組凝膠過濾色譜填料第三組1概述凝膠過濾色譜分離原理凝膠過濾色譜填料的種類和性能凝膠色譜填料的制備常見凝膠過濾色譜填料目錄凝膠過濾色譜的應(yīng)用概凝凝凝常目錄2概述凝膠過濾色譜是體積排除色譜（SEC）的一種。溶質(zhì)只依據(jù)其分子體積（流體力學(xué)體積）的大小而分離。體積排除色譜（SEC）概述凝膠過濾色譜是體積排除色譜（SEC）的一種。3與其他色譜相比較的優(yōu)點(diǎn)：①出峰迅速，任何組分的保留體積均在Vi和V0之間，且不需要梯度淋洗。②溶質(zhì)與固定相（填料）和流動(dòng)相之間沒有相互作用。③分離時(shí)不會(huì)滯留雜質(zhì)或殘留物在柱上，故柱壽命長。與其他色譜相比較的優(yōu)點(diǎn)：①出峰迅速，任何組分的保留體積均在V4與其他色譜相比較的優(yōu)點(diǎn)：④可用于測定生物大分子的分子量⑤生物相容性好，有很高的活性回收率⑥負(fù)載量較大，利于制備分離。與其他色譜相比較的優(yōu)點(diǎn)：④可用于測定生物大分子的分子量⑤生物5

主要缺點(diǎn)：分辨率及峰容量均相對較低。主要缺點(diǎn)：分辨率及峰6凝膠過濾色譜的分離原理◆凝膠過濾色譜是在裝填有多孔性材料的色譜柱中進(jìn)。◆當(dāng)流動(dòng)相攜帶分子量不同的溶質(zhì)進(jìn)入色譜柱后。①因濃度差而可能滲入或擴(kuò)散進(jìn)入填料的孔中，即溶質(zhì)在兩相中的運(yùn)動(dòng)是由濃度梯度推動(dòng)的。②分子體積的大小，造成了在孔中擴(kuò)散途徑的差異，溶質(zhì)分子只能進(jìn)入尺寸比它大的孔；

如果溶質(zhì)分子的尺寸大于孔徑，則只能從孔旁流過。這意味著體積較小的分子能占有更多的孔體積。這樣，分子體積不同的混合物一起進(jìn)入柱端時(shí)，經(jīng)過淋洗、擴(kuò)散，總是體積大的分子先流出柱子，小分子量即體積小的分子印刻進(jìn)入凝膠的孔中，使其行程延長而滯后流出，從而使分子體積不同的分子得以分離。凝膠過濾色譜的分離原理◆凝膠過濾色譜是在裝填有多孔性材料的色7凝膠過濾色譜填料的種類和性能用于凝膠色譜的填料主要是用天然的多糖類原料制成的，它們的機(jī)械強(qiáng)度低，粒徑較大而不均勻，很難在高流速下流動(dòng)，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且分辨率也很低。早期凝膠過濾色譜填料的種類和性能用于凝膠色譜的填料主要是8理想的高效凝膠色譜填料應(yīng)具備以下性能：1.機(jī)械強(qiáng)度高，能耐受幾兆帕的操作壓力。2.球形顆粒，粒子直徑控制在3~10um，且粒徑分布窄，達(dá)到高柱效。3.具有親水性表面，以利降低疏水性效應(yīng)。4.非離子性，表面沒有離子交換基團(tuán)。5.孔徑約為5~100nm之間，以適應(yīng)不同分子量范圍物質(zhì)的分離只需。6.具有較高的孔徑，以利于得到高分容量。7.較高的化學(xué)穩(wěn)定性，有較寬的適用PH值范圍.8.有較好的生物相容性，不會(huì)引起生物活性物質(zhì)的失活和降解。9.容易處理和充填。10.價(jià)格合理。理想的高效凝膠色譜填料應(yīng)具備以下性能：1.機(jī)械強(qiáng)度高，能耐受9

以可控孔徑玻璃（CPG）、硅膠為基質(zhì)的無機(jī)基質(zhì)高效凝膠色譜填料和以合成高分子或高交聯(lián)天然高分子為基質(zhì)的有機(jī)高效凝膠色譜填料相繼問世，他們均基本上可以滿足上述要求。20世紀(jì)70年代中期以可控孔徑玻璃（CPG）、硅膠為基質(zhì)的無機(jī)基質(zhì)高效凝膠10！??！填料基本參數(shù)孔徑或孔徑分布粒度及粒度分布孔容粒徑及粒徑分影響其柱效例如，通常所使用的直徑5um的軟膠，能達(dá)到理論塔板數(shù)1500/m左右的柱效關(guān)系到凝膠色譜柱的分離容量。根據(jù)凝膠色譜柱的一般理論，孔容愈大，所填裝的柱子的分辨率和柱子的容量就愈高。因此，用作凝膠分離介質(zhì)的硅膠，必須具有較高的孔容。

因此，用作凝膠分離介質(zhì)的硅膠，必須具有較高的孔度。對于多空硅膠而言，Ψ一般在0.6~0.7，故Vi/V0值應(yīng)在1.05~1.23之間?。?！填料基本參數(shù)孔徑或孔徑分布11指的是可用于分離的樣品的最大分子量。一般以具有不同分子量的葡聚糖，聚乙二醇為樣品繪制工作曲線后確定。需要注意的一點(diǎn)是，因?yàn)樵谌芤褐械鞍踪|(zhì)常呈球形，而PEG和葡聚糖則是線性分子，依據(jù)此工作曲線會(huì)帶來很大的誤差。故最好以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來標(biāo)定凝膠過濾色譜的工作曲線。凝膠過濾色譜的滲透極限：指的是可用于分離的樣品的最大分子量。凝膠過濾色譜的滲12由工作曲線可確定該凝膠過濾色譜柱的分離范圍，指的是工作曲線線性部分所對應(yīng)的分子量區(qū)間。！因此：！由工作曲線可確定該凝膠過濾色譜柱的分離范圍，指的是工作13凝膠色譜填料的制備未經(jīng)化學(xué)鍵合或改性的多空硅膠或可控孔徑玻璃，可以直接用于中性糖的寡聚物和聚合物的分離，近年來，經(jīng)葡聚糖鍵合至硅膠上或包敷在硅膠上制成的填料亦有報(bào)道和銷售。但用于生物高分子，如蛋白質(zhì)、核酸等分離時(shí)，還是以進(jìn)行表面親和處理為宜。即將其表面加以修飾，令其帶上親水性基團(tuán)。制備方法如下：見書246即以環(huán)氧丙基三甲氧基硅烷為硅烷化試劑，以高孔隙度硅膠為基質(zhì)，鍵合反應(yīng)后，再令其環(huán)氧基開環(huán)，生成二醇型化學(xué)鍵合硅膠。凝膠色譜填料的制備未經(jīng)化學(xué)鍵合或改性的多空硅膠或可控孔徑玻璃14常見凝膠過濾色譜填料

表11-8列出了常見的無機(jī)型親水凝膠，盡管牌號(hào)各異，但其化學(xué)本質(zhì)幾乎均是二醇型化學(xué)鍵合硅膠。！見書本247頁常見凝膠過濾色譜填料

表11-8列出了常見的無機(jī)型親水凝膠，15凝膠過濾色譜的應(yīng)用例1.凝膠過濾色譜分離大豆抗氧化肽活性利用木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白制備大豆肽的水解液，水解液經(jīng)SephadexG-25凝膠過濾色譜進(jìn)行分子量分級，根據(jù)分離圖譜確定柱層析的最佳條件。在最佳條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷分離組分的分子量分布。采用鐵離子還原/抗氧化能力測定法（FRAP）、二苯基苦基苯肼法（DPPH）以及金屬銅離子螯合能力測定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化能力，并對抗氧化活性最佳的肽段進(jìn)行進(jìn)一步的HPLC分離和氨基酸組成分析凝膠過濾色譜的應(yīng)用例1.凝膠過濾色譜分離大豆抗氧化肽活性16凝膠過濾色譜的應(yīng)用例2.蛇毒纖溶酶Fibrolase的凝膠過濾色譜復(fù)性

方法:使用透析和凝膠色譜對Fibrolase復(fù)性進(jìn)行研究,比較2種復(fù)性方法的相對復(fù)性率及蛋白質(zhì)回收率。結(jié)果:2種復(fù)性方法的復(fù)性率分別為20%、25%,蛋白質(zhì)回收率分別為16%、5%。結(jié)論:凝膠過濾色譜復(fù)性優(yōu)于透析法復(fù)性,凝膠過濾色譜復(fù)性使蛋白質(zhì)的復(fù)性與純化同步進(jìn)行,簡化了操作程序,提高了產(chǎn)品回收率。凝膠過濾色譜的應(yīng)用例2.蛇毒纖溶酶Fibrolase的凝膠17凝膠過濾色譜的應(yīng)用例3.葡聚糖凝膠過濾色譜柱法測定兩種氨基酸鋅螯合物螯合率的差異性采用葡聚糖凝膠過濾色譜柱法測定蛋氨酸鋅、蘇氨酸鋅兩種氨基酸鋅螯合物的螯合率，發(fā)現(xiàn)該法測定結(jié)果與其他測定方法分析結(jié)果一致，表明