環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝課件

環(huán)境微生物學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境微生物學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院1第3章微生物的生長與代謝第三節(jié)環(huán)境微生物的生長繁殖第3章微生物的生長與代謝第三節(jié)環(huán)境微生物的生長繁殖2微生物純培養(yǎng)技術(shù)微生物的生長繁殖

(1)分離

(2)培養(yǎng)(3)純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯微生物純培養(yǎng)技術(shù)(1)分離(2)培3一、微生物純培養(yǎng)的概念實驗室條件下，由一個微生物細胞或一種細胞群繁殖得到的后代。一、微生物純培養(yǎng)的概念實驗室條件下，由一個微生物細胞或一種細4二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)純培養(yǎng)基本步驟：(2)培養(yǎng)(1)分離二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)純培養(yǎng)基本步驟：(2)5無菌技術(shù)

分離、純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其他微生物污染的技術(shù)被稱為無菌技術(shù)，它是保證微生物學(xué)研究正常進行的關(guān)鍵。無菌技術(shù)分離、純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微6接種操作用接種環(huán)或接種針分離微生物，或在無菌條件下把微生物由一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接到另一個培養(yǎng)容器進行培養(yǎng)，是微生物學(xué)研究中最常用的基本操作。由于打開器皿就可能引起器皿內(nèi)部被環(huán)境中的其他微生物污染，因此微生物實驗的所有操作均應(yīng)在無菌條件下進行，其要點是在火焰附近進行熟練的無菌操作，或在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境下進行操作。接種操作7用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據(jù)。大多數(shù)細菌、酵母菌，以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)8所謂平板，即培養(yǎng)平板(cultureplate)的簡稱，它是指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。固體培養(yǎng)方法可將單個微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。所謂平板，即培養(yǎng)平板(cultureplate)的簡稱，它9固體培養(yǎng)基(用瓊脂或其他凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基)，可使每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。Koch建立的平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。固體培養(yǎng)基(用瓊脂或其他凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基)，可使每個孤立10稀釋倒平板法涂布平板法平板劃線分離法單細胞挑取法純培養(yǎng)方法稀釋倒平板法純培養(yǎng)方法111.稀釋倒平板法

待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋，取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間，可能出現(xiàn)在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)1.稀釋倒平板法

待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋，取不同12二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)1、稀釋平板分離法：傾注平板法和涂布平板法。基本過程：（1）梯度稀釋過程；（2）分離培養(yǎng)過程涂布傾注梯度稀釋過程10-110-210-310-410-510-6二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)1、稀釋平板分離法：傾注平板法和涂布平板134)操作要點：

無菌操作稀釋平板分離法使用過程中的幾個問題1)梯度稀釋度的確定：需分離微生物在樣品中的數(shù)量2)選擇菌落接種的依據(jù)：a、菌落特征；b、菌體的特征3)微生物純培養(yǎng)的標準：菌落特征一致性4)操作要點：稀釋平板分離法使用過程中的幾個問題1)梯度142.涂布平板法

在微生物學(xué)研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒人無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落。二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)2.涂布平板法二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)15環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件16環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件173.平板劃線分離法

用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)3.平板劃線分離法二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)18環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件19環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件20環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件21環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件22平板劃線分離法（StreakPlate）特點：快速、方便。

分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品）

連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）平板劃線分離法（StreakPlate）特點：快速、方便。234、單細胞挑取法：

從待分離材料中挑取一個細胞來培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)的過程。二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)4、單細胞挑取法：二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)24單細胞(單孢子)分離

采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細胞(單孢子)分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。單細胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。

單細胞(單孢子)分離25三、目標微生物純培養(yǎng)篩選的基本思路１、待分離樣品的確定２、培養(yǎng)基的選擇３、純化過程環(huán)境條件的控制（溫度、空氣、PＨ、抑制劑）（Ｐ１３８－１４１）三、目標微生物純培養(yǎng)篩選的基本思路１、待分離樣品的確定２、培26（一）純培養(yǎng)的保存試管斜面培養(yǎng)基低溫、干燥、隔絕空氣四、純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯1、滅菌徹底2、棉塞大小要合適3、無菌操作保存過程的注意點：防止雜菌污染。（一）純培養(yǎng)的保存四、純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯1、滅菌徹底保存過程27通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時間內(nèi)不死亡，不會被其他微生物污染，不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進行。菌種或培養(yǎng)物保藏是一項最重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作，微生物菌種是珍貴的自然資源，具有重要意義。通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，必須通過各種保藏技術(shù)使其在28傳代培養(yǎng)保藏常用的有瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)等。選擇使用適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定的時間內(nèi)進行移種。傳代培養(yǎng)十分繁瑣，容易污染，特別是會由于菌株的自發(fā)突變而導(dǎo)致菌種衰退，使菌株的形態(tài)、生理特性、代謝物的產(chǎn)量等發(fā)生變化。傳代培養(yǎng)保藏29（二）純培養(yǎng)的衰退與復(fù)壯四、純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯衰退的原因：衰老、變異衰退的表現(xiàn)：生長緩慢優(yōu)良性狀的喪失抗逆性下降衰退的預(yù)防：控制繼代頻率創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件采取有效的保存方式復(fù)壯狹義（被動）廣義（主動）復(fù)壯方法：選優(yōu)汰劣（二）純培養(yǎng)的衰退與復(fù)壯四、純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯衰退的原因：衰30微生物生長的指標(生物量的測定)細胞群體數(shù)量的增加細胞群體總重量增加從群體水平上衡量(間接的測定方法)微生物的生長繁殖

細菌的個體生長

細菌的群體生長繁殖微生物生長的指標細胞群體數(shù)量的增加從群體水平上衡量微生物的生31微生物生長繁殖

微生物生長是細胞物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致細胞體積擴大的生物學(xué)過程，這是個體生長的定義。繁殖是微生物生長到一定階段，由于細胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通過特定方式產(chǎn)生新的生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。在一定時間和條件下細胞數(shù)量的增加，這是微生物群體生長的定義。微生物生長繁殖32細菌的個體生長細菌的個體生長包括細胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與再生、細胞的分裂與控制：染色體DNA的復(fù)制和分離細胞壁擴增細菌的分裂細菌的個體生長33細菌的群體生長繁殖

細菌接種到均勻的液體培養(yǎng)基后，在不補充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個培養(yǎng)液體積不變條件下，以時間為橫坐標，以菌數(shù)為縱坐標，根據(jù)不同培養(yǎng)時間里細菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線，這種曲線稱為生長曲線。細菌的群體生長繁殖

細菌接種到均勻的液體培養(yǎng)基后，在不補充營34一、微生物生長量的測定微生物生長量的測定微生物數(shù)量的測定顯微鏡直接計數(shù)法稀釋平板計數(shù)法最大概率法比濁法稱重法含N量測定法DNA含量測定法ATP含量測定法代謝活性法微生物重量的測定一、微生物生長量的測定微生物生長量的測定微生物數(shù)量的測定顯微35(一)微生物數(shù)量的測定1、顯微鏡直接計數(shù)法使用細菌計數(shù)板或血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。優(yōu)點：操作簡便，計數(shù)直觀。一、微生物生長量的測定(一)微生物數(shù)量的測定一、微生物生長量的測定36直接計數(shù)

這類方法是利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點不能區(qū)分死菌與活菌。

每毫升原液所含細菌數(shù)

＝每小格平均細菌數(shù)×400×l000×稀釋倍數(shù)直接計數(shù)

這類方法是利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯37環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件38環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件39(一)微生物數(shù)量的測定2、稀釋平板計數(shù)法對樣品稀釋培養(yǎng)，據(jù)形成的菌落數(shù)計數(shù)。優(yōu)點：傳統(tǒng)計數(shù)方法。對設(shè)備要求不高。一、微生物生長量的測定10-310-510-410-6(一)微生物數(shù)量的測定一、微生物生長量的測定10-310-40

此法又稱活菌計數(shù)法，其原理是每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。

每毫升原菌液活菌數(shù)＝

同一稀釋度三個以上重復(fù)平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)

此法又稱活菌計數(shù)法，其原理是每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好41環(huán)境微生物學(xué)-微生物的生長與代謝ppt課件423.平板菌落計數(shù)法3.平板菌落計數(shù)法43★技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴格無菌操作；★注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養(yǎng)基溫度；★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物，★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當操作★技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成44(一)微生物數(shù)量的測定３、比濁計數(shù)法根據(jù)細菌懸浮液的吸光度測定其數(shù)量。優(yōu)點：簡便，直接。一、微生物生長量的測定(一)微生物數(shù)量的測定一、微生物生長量的測定45(二)微生物重量的測定1、稱重法用離心或過濾的方法將菌體從培養(yǎng)基中分離、冼凈，稱濕重或干重。優(yōu)點：簡單可靠。一、微生物生長量的測定在活性污泥法中采用的指標：（1）混合液懸浮固體(MLSS)（粗放測定）污泥—干燥----稱重(W1)（2）揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)（相對準確）上述已稱重污泥-----馬福爐(500度2小時)----冷卻---稱重(W2)(二)微生物重量的測定一、微生物生長量的測定在活性污泥法中46(二)微生物重量的測定2、含氮量測定法

根據(jù)樣品中菌體蛋白質(zhì)含量計算微生物重量的方法。

一、微生物生長量的測定原理：（1）微生物蛋白質(zhì)含量穩(wěn)定（2）氮是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定成分(蛋白質(zhì)量=6.25×總含N量)優(yōu)點：測定準確。(二)微生物重量的測定一、微生物生長量的測定原理：（1）微47二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律分批培養(yǎng)：將少量的細菌接種到一定體積的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，最后一次性收獲的過程。生長曲線：細菌在新的適宜的環(huán)境中生長、繁殖、衰老、死亡的動態(tài)變化。二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律分批培養(yǎng)：將少量的細菌接種到一定48㏒細胞數(shù)

延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期單細胞微生物的典型生長曲線二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律根據(jù)細菌生長繁殖速率將生長曲線分四個階段：二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律根據(jù)細菌生長繁殖49滯留適應(yīng)期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律特點：分裂遲緩、代謝活躍。產(chǎn)生原因：（2）細胞分裂必需因子的缺乏（1）接種時的機械損傷引延遲期（滯留適應(yīng)期）滯留適應(yīng)期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律特點：50延遲期（滯留適應(yīng)期）4、菌株的遺傳性滯留適應(yīng)期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律研究滯留適期長短的意義？影響延遲期長短的因素：1、培養(yǎng)基成分2、接種物菌齡3、接種量延遲期（滯留適應(yīng)期）4、菌株的遺傳性滯留適應(yīng)期二、細菌分批培51對數(shù)期（指數(shù)生長期）特點：（1）代謝活性強（2）世代時短而穩(wěn)定對數(shù)生長期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律對數(shù)期（指數(shù)生長期）特點：對數(shù)生長期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長52對數(shù)期（指數(shù)生長期）對數(shù)生長期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律見教材P93Nt=2nN0n=3.33(lgNt-lgN0)G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0)

n——繁殖代數(shù)G——世代時(每繁殖一代所需的時間)N0——對數(shù)生長期開始微生物數(shù)量Nt——對數(shù)生長期經(jīng)過時間t后微生物數(shù)量對數(shù)期（指數(shù)生長期）對數(shù)生長期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律見53穩(wěn)定期（最高生長量期）最高生長量期特點：1、細菌數(shù)量增加率為0。2、部分細菌大量積累代謝產(chǎn)物。細菌數(shù)量增加率為0的原因?二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律穩(wěn)定期（最高生長量期）最高生長量期特點：細菌數(shù)量增加率為54衰亡期特點：菌體活性降低、大量死亡；細胞畸變、自溶革蘭氏染色不穩(wěn)定衰亡期二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律衰亡期特點：菌體活性降低、大量死亡；衰亡期二、細菌55什么時期菌體代謝產(chǎn)物最多什么時期細菌細胞代謝活性最強什么時候細菌細胞總數(shù)最多什么時期細菌細胞生長速度最快什么時期世代時間短而穩(wěn)定對數(shù)生長期最高生長量最高生長量對數(shù)生長期對數(shù)生長期小結(jié)二、細菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律什么時期菌體代謝產(chǎn)物最多什么時期細菌細胞代謝活性最強什么時候56二、連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）分批培養(yǎng)（batchculture）：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。二、連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）分批培養(yǎng)57原理：當微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達到對數(shù)期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細胞數(shù)（個/ml）連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)原理原理：當微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達到對數(shù)期后期時，一方面以58二、連續(xù)培養(yǎng)以一定流速輸入新鮮培養(yǎng)液并流出培養(yǎng)物，確保流出的老菌數(shù)等于新增殖數(shù)，使培養(yǎng)保持對數(shù)生長的過程。優(yōu)點：一定生理狀態(tài)實驗材料提高工業(yè)生產(chǎn)效益二、連續(xù)培養(yǎng)以一定流速輸入新鮮培養(yǎng)液并流出培59保持細菌培養(yǎng)液濁度恒濁培養(yǎng)二、連續(xù)培養(yǎng)保持細菌培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒化培養(yǎng)保持細菌培養(yǎng)液濁度恒濁培養(yǎng)二、連續(xù)培養(yǎng)保持細菌培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)60連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細菌生長速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長因子等），使其始終成為生長限制因子，而達到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖。特點：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實驗室科學(xué)研究連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒61恒化器Chemostat或bactogen

恒化器Chemostat或bactogen

62概念：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保