毛建茶的制備及質(zhì)量控制

毛建茶的制備及質(zhì)量控制

酒精性肝?。╝ld）是指短期大量飲酒或長(zhǎng)期飲酒對(duì)肝臟的毒性病理性損害。它最初是由肝臟脂肪惡化引起的，然后是由酒精性肝炎引起的，最終是肝臟實(shí)質(zhì)化和酒精性肝硬化。1材料和方法1.1動(dòng)物、試劑與儀器毛建茶山西省神池縣某毛建茶加工廠；鹽酸納洛酮注射液海南靈康制藥有限公司（批號(hào)：190101112）；東寶肝泰片通化東寶藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：180113）；清潔級(jí)昆明種小鼠（雌雄各半，體重：18～20g）山西醫(yī)科大學(xué)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)-SCXK(晉)2015-0001；SPF級(jí)SD大鼠（雌雄各半，體重：180～220g）山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：20180006003154；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧酶（SOD）、還原性谷胱甘肽（GSH）、BCA蛋白定量試劑盒南京建成生物工程研究所。DNM-9602酶標(biāo)分析儀北京普朗新技術(shù)有限公司；Eclipseci顯微鏡日本NIKON公司；DigitalsightDS-FI2成像系統(tǒng)日本NIKON公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1制備茶液毛建茶1kg用10倍量水浸泡1h后，煎煮1h后濾取茶液，第二次煎煮加8倍量水后煎煮1h，合并2次茶液，濃縮至0.3g/mL，置于4℃冰箱中保存待用。實(shí)驗(yàn)過程毛建茶水提物（文中簡(jiǎn)稱毛建茶）高、中、低劑量組灌胃濃度分別為0.3、0.15、0.075g/mL。1.2.2毛建茶固酒的作用研究1.2.2.毛建茶單次用藥實(shí)驗(yàn)昆明小鼠50只飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)普通環(huán)境動(dòng)物房中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后隨機(jī)分為醉酒模型組(D-M)、鹽酸納洛酮組(NH)和毛建茶高劑量組(MJ-H)、中劑量組(MJ-M)、低劑量組(MJ-L)，鹽酸納洛酮組腹腔注射鹽酸納洛酮注射液（0.002g/kg/d），毛建茶高、中、低劑量組分別灌胃給予毛建茶水提物3g/kg、1.5g/kg、0.75g/kg。1.2.2.2.飲酒大鼠喝醉時(shí)間和酒精時(shí)間的測(cè)定各組提前禁食16h，毛建茶組按給藥劑量單次灌胃后2h（醉酒模型組灌服蒸餾水），參考文獻(xiàn)中醉酒模型的造模方法1.2.3毛建茶對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠肝臟的保護(hù)作用研究1.2.3.各組大鼠肝損傷模型60只SD大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)普通環(huán)境動(dòng)物房中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得山西中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后隨機(jī)分成6組：空白組(CON)、慢性酒精性肝損傷模型組(ALI-M)、東寶肝泰組（DBGT,東寶肝泰片0.36g/kg）毛建茶高劑量組（MJ-H,3g/kg）、毛建茶中劑量組（MJ-M,1.5g/kg）、毛建茶低劑量組（MJ-L,0.75g/kg）。各組大鼠上午以濃度為50%酒精1mL/100g灌胃，連續(xù)6w以造成慢性酒精性肝損傷模型1.2.3.血清分離實(shí)驗(yàn)第6w結(jié)束，大鼠禁食不禁水12h，末次給藥1h后，10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血，將全血注入空白潔凈試管內(nèi)，離心后（3000r/min，15min，4℃）分離血清，-80℃凍存待檢血清。根據(jù)試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中ALT、AST、TC、TG的含量。1.2.3.肝組織中mda、sod、gsh的檢測(cè)末次給藥1h后，麻醉大鼠采血后，摘取肝臟，稱取0.5xa0g肝組織于液氮中保存，制備肝勻漿后，蛋白定量后按試劑盒說明書操作，測(cè)定MDA、SOD、GSH的含量。1.2.3.肝臟組織病理學(xué)觀察末次給藥1h后，腹主動(dòng)脈取血后摘取每只大鼠的肝臟，置于10%中性福爾馬林中固定，常規(guī)取材，脫水，包埋，制片，H&E染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3處理數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2結(jié)果與分析2.1小鼠酒精造模及酒精時(shí)間比較實(shí)驗(yàn)過程中D-M組在給予酒精后1.5h內(nèi)10只小鼠翻正反射全部消失，并持續(xù)至7h，醉酒模型造模成功。如表1所示：與D-M組比較，NH組、MJ-H組、MJ-M組MJ-L組小鼠的醉酒時(shí)間有延長(zhǎng)的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；NH組以及MJ-H組、MJ-M組MJ-L組醒酒時(shí)間均極顯著縮短（2.2alt、ast活性的變化正常肝細(xì)胞內(nèi)ALT、AST主要分布在肝細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷后，胞內(nèi)的ALT、AST會(huì)透過細(xì)胞膜流入血液中，因此血清中ALT、AST的活性高低常用以反映肝細(xì)胞損傷程度過量酒精導(dǎo)致肝細(xì)胞膜磷脂發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂自由基，導(dǎo)致脂肪酸的β氧化障礙，肝細(xì)胞中TG的代謝紊亂，出現(xiàn)脂肪堆積2.3mda、gsh及sod活性酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的過程中，會(huì)有大量活性氧自由基產(chǎn)生，引起肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物MDA含量增加，并且加快可清除自由基的抗氧化物質(zhì)GSH和SOD的消耗，因此肝組織中MDA、GSH含量及SOD活性的高低可以反映肝細(xì)胞氧化損傷程度的大小2.4組織病理學(xué)結(jié)果如圖4所示：CON組肝細(xì)胞排列整齊，無明顯脂肪空泡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；ALD-M組肝組織可見肝細(xì)胞脂肪變性，胞質(zhì)中含有較多小的脂肪空泡；局部靜脈周圍可見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；經(jīng)治療后DBGT組肝組織中無明顯脂肪空泡，偶有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；MJ-H組和MJ-M組仍可見少量小的脂肪空泡，MJ-L組無明顯脂肪空泡，毛建茶各劑量組肝組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。3毛建茶降脂作用的量效關(guān)系A(chǔ)LD是臨床常見的導(dǎo)致肝功能障礙以及肝相關(guān)疾病致死的常見原因，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，乙醇及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的損傷、氧化應(yīng)激為其主要發(fā)病機(jī)制根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)提出的ALD診療指南，其臨床可分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化４個(gè)類型慢性酒精性肝損傷引起的脂質(zhì)堆積以TG升高為主，本次慢性酒精性肝損傷模型也表現(xiàn)為以TG升高為主，TC僅輕度升高。由于病理切片中肝脂肪變性所形成的細(xì)胞內(nèi)空泡其主要成分是TG，光鏡下觀察毛建草低劑量組改善脂肪變性的作用最為明顯，與生化指標(biāo)變化一致。毛建茶高劑量組能夠顯著降低TC，低劑量組能夠顯著降低TG水平，具有一定的降血脂作用，但毛建茶調(diào)節(jié)血脂的劑量關(guān)系有待進(jìn)一步優(yōu)化，今后應(yīng)結(jié)合高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）等載脂蛋白指標(biāo)以及甘油三酯和膽固醇各自的代謝通路進(jìn)一步探討毛建茶降脂作用量效關(guān)系和作用機(jī)制。本次研究對(duì)毛建茶的解酒和保肝作用進(jìn)行了研究，并從