保元湯對(duì)蓮花隱桿線蟲(chóng)的抗衰老作用及機(jī)制研究

保元湯對(duì)蓮花隱桿線蟲(chóng)的抗衰老作用及機(jī)制研究

寶元湯最初出現(xiàn)在明代的《愛(ài)心經(jīng)》中。這是治療情緒虛弱的著名方劑。這組藥物包括黃原、人參、甘草和肉桂。它們可以補(bǔ)充很多空氣，補(bǔ)充后天的脾臟和肺氣，健康的脾臟，保護(hù)肺部，溫腎，治療氣弱性疾病。因此，包元湯被稱為保元湯，并通過(guò)歷代醫(yī)家的臨床應(yīng)用來(lái)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。1材料和方法1.1長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株野生型N2秀麗隱桿線蟲(chóng)，采用線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(NGM)，以大腸桿菌EscherichiacoliOP50飼喂，由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)提供。1.2藥物和試劑1.2.1實(shí)驗(yàn)藥物保元湯藥物組成:黃芪、人參、甘草、肉桂，比例6∶2∶2∶1(北京同仁堂南京藥店有限公司)。1.2.2測(cè)試試劑NGM培養(yǎng)基配方:氯化鈉(NaCl)3g，蛋白胨2.5g，瓊脂17g，磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀(K1.3高壓滅菌鍋及生化培養(yǎng)箱超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司);顯微鏡(日本Olympus公司);高壓滅菌鍋[致微(廈門(mén))儀器有限公司];生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1保元湯粗提物的制備依據(jù)保元湯方藥物比例稱取藥材30g，研成粉末，加10倍量水采用回流提取法提取1h，提取3次，合并3次藥液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至100mL，最后采用真空冷凍干燥法獲得保元湯粗提物。1.4.2秀麗隱桿線蟲(chóng)接種于空白的NGM培養(yǎng)基中央滴入50μL左右的大腸桿菌菌液，用涂布器將菌液均勻涂布，注意菌液邊緣不宜太過(guò)，應(yīng)距離平板邊緣5mm左右，采用團(tuán)塊法將秀麗隱桿線蟲(chóng)接種在含大腸桿菌的NGM培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1.4.3秀麗隱桿線蟲(chóng)線蟲(chóng)裂解觀察用液體NGM沖下培養(yǎng)基中的L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)成蟲(chóng)，轉(zhuǎn)至10mL無(wú)菌離心管中，高心機(jī)1300×g離心1min，洗滌2次，保留與約0.25mLNGM，加無(wú)菌水3.75mL，加堿裂解液[氫氧化鈉(NaOH)(5mol/L)0.5mL，漂白劑(Bleach)1mL]至混勻振蕩，每2min至于顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲(chóng)線蟲(chóng)裂解狀態(tài)，裂解時(shí)間不超過(guò)6min。1300×g離心1min，液體NGM洗滌2次，S-培養(yǎng)基洗滌2次，移除上清，加S-培養(yǎng)基8mL，置于20℃培養(yǎng)箱中振搖孵育24h，從而得到生長(zhǎng)同期化的秀麗隱桿線蟲(chóng)1.5觀察指標(biāo)和方法1.5.1觀察時(shí)間及監(jiān)測(cè)結(jié)果比較各組秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲(chóng)由卵成長(zhǎng)至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)，每組100條左右，給藥當(dāng)日年齡標(biāo)記為0。每日顯微鏡觀察秀麗隱桿線蟲(chóng)的狀態(tài)，記錄存活、死亡數(shù)量，計(jì)算平均壽命。觀測(cè)前將96孔板置于搖床上輕輕振搖2min，秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為振動(dòng)或強(qiáng)光刺激秀麗隱桿線蟲(chóng)不彎曲身體或頭部不擺動(dòng)，身體呈僵直狀態(tài)。1.5.2各組不同給藥時(shí)間比較各組秀麗隱桿線蟲(chóng)的生殖力變化情況，采用同期化的L1期秀麗隱桿線蟲(chóng)觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲(chóng)由卵成長(zhǎng)至L1期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)48h后，用移液器吸取秀麗隱桿線蟲(chóng)，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5mL離心管中，1300×g離心1min。移除上清，加線蟲(chóng)M9緩沖液，1300×g離心1min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲(chóng)至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板1條，每組15條，轉(zhuǎn)移至20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)每塊培養(yǎng)皿上的蟲(chóng)卵數(shù)目。1.5.3預(yù)給藥、給藥及藥物干預(yù)的運(yùn)動(dòng)能力變化情況，正常情況下其以S形向前移動(dòng)，衰老后運(yùn)動(dòng)能力下降，運(yùn)動(dòng)彎曲的頻率減少，可反映其生命活力，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲(chóng)由卵成長(zhǎng)至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)6d后，用移液器吸取線蟲(chóng)，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5mL離心管中，1300×g離心1min。移除上清，加線蟲(chóng)M9緩沖液，1300×g離心1min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲(chóng)至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板5條，每組15條，讓其自由運(yùn)動(dòng)1min，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲(chóng)1min內(nèi)運(yùn)動(dòng)S形的個(gè)數(shù)(即1min內(nèi)走過(guò)的峰數(shù))，重復(fù)3次。1.5.4移液加線蟲(chóng)觀察比較各組秀麗隱桿線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)變化情況，頭部擺動(dòng)行為定義為頭部擺動(dòng)方向改變且改變角度大于90°，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲(chóng)由卵成長(zhǎng)至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)6d后，用移液器吸取線蟲(chóng)，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5mL離心管中，1300×g離心1min。移除上清，加線蟲(chóng)M9緩沖液，1300×g離心1min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲(chóng)至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板5條，每組15條，讓其自由運(yùn)動(dòng)1min后，觀察記錄其在1min內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)。1.5.5給藥干預(yù)干預(yù)比較各組秀麗隱桿線蟲(chóng)的熱應(yīng)激能力變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲(chóng)由卵成長(zhǎng)至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物處理2d后，每組15條，去除封口膜，將96孔板上秀麗隱桿線蟲(chóng)一起轉(zhuǎn)移到35℃培養(yǎng)箱中熱應(yīng)激10h，然后再將其轉(zhuǎn)移到20℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察記錄秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡、存活條數(shù)，直至空白對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)存活率<10%。存活率(%)=(總數(shù)-死亡數(shù)目)/總數(shù)×100%。1.5.6不同機(jī)溶劑給藥干預(yù)比較各組秀麗隱桿線蟲(chóng)的氧化應(yīng)激能力變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲(chóng)由卵成長(zhǎng)至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。。藥物處理2d后，每組15條，各組分別加入20mmol/L百草枯，進(jìn)行氧化應(yīng)激處理，培養(yǎng)24d后，開(kāi)始每日顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡、存活條數(shù)，直至空白對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)存活率<10%。1.6統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPadPrism5.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差2結(jié)果2.1各組秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命情況比較由表1可見(jiàn)，溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)平均壽命與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中100、200、500μg/mL組秀麗隱桿線蟲(chóng)平均壽命較空白對(duì)照組均明顯延長(zhǎng)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);50、1000μg/mL組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2各組大鼠產(chǎn)卵量、保元湯時(shí)間比較由表2可見(jiàn)，溶劑對(duì)照組及保元湯各組秀麗隱桿線蟲(chóng)平均產(chǎn)卵量與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，保元湯各組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.3各組秀麗隱桿線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力情況比較由表3可見(jiàn)，溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)1min平均運(yùn)動(dòng)峰數(shù)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中200、500、1000μg/mL組秀麗隱桿線蟲(chóng)1min平均運(yùn)動(dòng)峰數(shù)較空白對(duì)照組均明顯增多，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);50、100μg/mL組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.4各組秀麗隱桿線蟲(chóng)擺動(dòng)情況比較由表4可見(jiàn)，溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)1min平均擺動(dòng)次數(shù)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中200、500、1000μg/mL組秀麗隱桿線蟲(chóng)1min平均擺動(dòng)次數(shù)較空白對(duì)照組均明顯增多，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);50、100μg/mL組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.5線蟲(chóng)熱性能比較熱應(yīng)激測(cè)試后的第1、2天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)均出現(xiàn)明顯死亡，而保元湯各組可以顯著提高秀麗隱桿線蟲(chóng)的耐熱能力，其中200、500、1000μg/mL組存活率均明顯高于空白對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。熱應(yīng)激測(cè)試第3天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)幾乎全部死亡，而保元湯各組還有約10%以上存活率，其中200、500、1000μg/mL組存活率明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。2.6各組秀麗隱桿線蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激損傷的能力氧化應(yīng)激測(cè)試第1、2、3天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)均出現(xiàn)明顯死亡，而保元湯各組可以顯著提高秀麗隱桿線蟲(chóng)的抗氧化應(yīng)激損傷的能力，其中200、500、1000μg/mL組存活率均明顯高于空白對(duì)照組。氧化應(yīng)激測(cè)試第4天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲(chóng)幾乎全部死亡，而保元湯各組還有約10%以上的存活率，其中200、500、1000μg/mL組存活率明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。3保元湯在不同給藥劑量對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響中醫(yī)學(xué)對(duì)衰老的認(rèn)識(shí)和研究源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，早在《內(nèi)經(jīng)》中就有“”正氣存內(nèi)，邪不可干”的論述，認(rèn)為氣是構(gòu)成人體和維持人體生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，機(jī)體正氣充足，則抵御外邪能力強(qiáng)，從而身強(qiáng)體健不易發(fā)病而可得“天年”，氣虛、氣不足可導(dǎo)致機(jī)體的臟腑功能減退，加速衰老衰老是指生物體在正常狀況下發(fā)育成熟后，隨著年齡的繼續(xù)增加，機(jī)體的生理功能出現(xiàn)逐漸下降的表現(xiàn)，最終導(dǎo)致生命體死亡的過(guò)程，因此在延緩衰老的研究中壽命的長(zhǎng)短可作為其一個(gè)定量指標(biāo)在衰老領(lǐng)域，長(zhǎng)壽和生殖總是被聯(lián)系在一起，且普遍認(rèn)為壽命與其生殖能力成反比關(guān)系，對(duì)大多數(shù)生物體而言，當(dāng)生殖期結(jié)束則機(jī)體就逐漸開(kāi)始呈現(xiàn)衰老。有研究認(rèn)為，包括線蟲(chóng)、黑腹果蠅、人類等有機(jī)體都有通過(guò)干預(yù)生殖功能來(lái)實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)壽命的可能性，但目前這個(gè)觀點(diǎn)還有頗多爭(zhēng)議運(yùn)動(dòng)能力可反映秀麗隱桿線蟲(chóng)的生命活力，秀麗隱桿線蟲(chóng)在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中以正弦曲線S的形式向前移動(dòng)，當(dāng)秀麗隱桿線蟲(chóng)出現(xiàn)衰老時(shí)其運(yùn)動(dòng)能力也會(huì)明顯下降，因此我們通過(guò)觀察秀麗隱桿線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)來(lái)輔助證明藥物延緩衰老的作用。同時(shí)秀麗隱桿線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)能力在一定程度上反映秀麗隱桿線蟲(chóng)的衰老，其頭部擺動(dòng)與身體肌壁組織、攝食行為有一定的關(guān)系，擺動(dòng)次數(shù)越多說(shuō)明，說(shuō)明其生命活力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，保元湯在200、500、