不同梯度細(xì)胞凍存方式的應(yīng)用的制作方法

不同梯度細(xì)胞凍存方式的應(yīng)用的制作方法引言細(xì)胞凍存是一種常用的技術(shù)，能夠延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞存儲(chǔ)時(shí)間，同時(shí)也是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期保護(hù)的方法。隨著技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)不同的梯度細(xì)胞凍存方式能夠適用于不同類(lèi)型的細(xì)胞，并且提高了細(xì)胞凍存的效率和成功率。本文主要介紹不同梯度細(xì)胞凍存方式的制作方法，幫助讀者更好地了解和掌握這些技術(shù)。一、Percoll梯度離心法Percoll梯度離心法是一種常用的細(xì)胞凍存方法，特別適用于淋巴細(xì)胞和血細(xì)胞的凍存。該方法的制作主要包括以下幾個(gè)步驟：1.準(zhǔn)備Percoll溶液取1mol/LNaCl制備PBS緩沖液；用PBS沖稀Percoll（20%）至10%的濃度，制成Percoll溶液；注意：制作中要注意消泡，避免空氣泡影響到細(xì)胞的分歧。2.收集細(xì)胞將需要凍存的細(xì)胞用PBS低速離心（1000rpm、8min），棄掉上清液，收集沉淀。3.制備細(xì)胞懸液向細(xì)胞沉淀中滴加滴加1mL/ml的PBS滲透液，輕輕攪拌，避免產(chǎn)生泡沫。4.添加Percoll溶液將制好的Percoll溶液注入離心管底部。按下列梯度層次從上至下依次加入：45%Percoll液體，重心位于液面上部；30%Percoll液體，重心位于液面中下部；5%Percoll液體，重心位于離心管筒底。5.細(xì)胞離心慢速離心，以便縮小懸浮細(xì)胞與Percoll溶液的差異。先加快離心轉(zhuǎn)速（加速度為2000G），達(dá)到保留“粉色帶”至少10分鐘。然后將Percoll中的細(xì)胞建立到泡沫中，并在離心管上部添加PBS（3000rpm，20min，4℃）來(lái)清除Percoll，并拉伸上清液即可。6.凍存細(xì)胞將凍存用的細(xì)胞加入適當(dāng)體積的10%DMSO或1mol/L冰凍甘油液中混合均勻，并逐滴加到冰凍管中。在嚴(yán)格控制冷卻速度中，放入二甲基亞砜（DMSO）內(nèi)部，低于-70℃儲(chǔ)存。這樣處理的凍細(xì)胞應(yīng)該立即放入氮罐中，保存于液氮中，以便將來(lái)的應(yīng)用。二、Ficoll梯度離心法Ficoll梯度離心法是一種較為通用的細(xì)胞凍存技術(shù)，適用于多種不同類(lèi)型的細(xì)胞。該方法的制作主要包括以下幾個(gè)步驟：1.制備Ficoll梯度液將Ficoll-PA40在70mlNB+復(fù)合液（NB+即細(xì)胞相關(guān)液體）中溶解，接著使用氣流抽泵進(jìn)行混合，最后加入到離心管中。2.細(xì)胞離心收集需要凍存的細(xì)胞，然后將其濃縮在0.5ml完全游離培養(yǎng)基中，緩慢加入等體積的Ficoll梯度液。3.快速離心使用高速離心進(jìn)行通過(guò)，以分離細(xì)胞和梯度液。為了避免細(xì)胞凝聚或損壞，建議設(shè)置離心保護(hù)，使用較為溫和的離心條件。4.凍存細(xì)胞將凍存用的細(xì)胞和冰冷的細(xì)胞凍存保護(hù)劑混合在一起，包裝到液氮罐中冷凍。三、Histopaque梯度離心法Histopaque梯度離心法是一種常用的細(xì)胞分離和凍存方法，適用于不同類(lèi)型的細(xì)胞，尤其適用于血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的分離和凍存。該方法的制作主要包括以下幾個(gè)步驟：1.制備Histopaque1077液使用PBS稀釋Histopaque1077溶液至10%濃度。2.細(xì)胞離心將待凍存的細(xì)胞樣本離心在轉(zhuǎn)速為400g的離心機(jī)上（轉(zhuǎn)速時(shí)間為30min）。3.添加Histopaque液取出棕色管口軟管，將離心后的上清液倒入軟管。加入等體積的10%Histopaque溶液（盡可能慢地加入）。4.快速離心將軟管立即離心以使細(xì)胞沉積在Histopaque表面上。5.取出細(xì)胞用微調(diào)鑷或吸管等工具在第3步中離心后的上層離心液中取出細(xì)胞。6.凍存細(xì)胞將細(xì)胞與冷卻的細(xì)胞凍存保護(hù)劑混合均勻，并儲(chǔ)存在液氮罐中，保存于液氮中。結(jié)論以上介紹的三種梯度細(xì)胞凍存方式都是比較常用的方法，對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞都能夠產(chǎn)生良好的凍存效果。