瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dna課件

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA丁新倫dingxinlun@163.co脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA丁新倫【一】背景知識(shí)凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)；分離、鑒定和提純核酸首選的標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)制備凝膠的材料:

瓊脂糖電泳凝膠電泳聚丙烯酰胺電泳【一】背景知識(shí)凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)；【二】實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法檢測(cè)堿裂解法提取質(zhì)粒的結(jié)果檢測(cè)雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒的結(jié)果檢測(cè)PCR法鑒定重組質(zhì)粒的結(jié)果【二】實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法【三】實(shí)驗(yàn)原理（1）某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳的速率，電泳的速率與核酸分子大小和構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構(gòu)型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可以分離大小不同的DNA或RNA分子。（2）瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。【三】實(shí)驗(yàn)原理（1）某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳的速瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來(lái)確定。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～6（3）溴化乙錠為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可判斷DNA分子量大小和粗略估計(jì)樣品DNA濃度。（3）溴化乙錠為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的【四】?jī)x器、材料與試劑質(zhì)粒樣品、酶切樣品和PCR樣品。凝膠電泳系統(tǒng)和電泳圖像分析系統(tǒng)(凝膠成像系統(tǒng))等。瓊脂糖、

1XTBE電泳緩沖液、溴化乙錠、

6X載樣緩沖液（

6Xloadingbuffer）和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（

LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarker）等。【四】?jī)x器、材料與試劑質(zhì)粒樣品、酶切樣品和PCR樣品。凝膠電泳系統(tǒng)DYY-6C型

雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源（北京六一）輸出范圍（顯示分辨率）：6-600V(1V)

4-400mA

(1mA)

240W

美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)小型水平電泳槽Mini-SubCellGTCell凝膠電泳系統(tǒng)DYY-6C型

雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源（北京六一）

凝膠成像分析系統(tǒng)

凝膠成像分析系統(tǒng)LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarker（Ferments）一個(gè)已知分子質(zhì)量的DNA樣品做最對(duì)照，用來(lái)確定待測(cè)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。LambdaDNA/EcoRI+HindIIIM常用電泳緩沖液緩沖液緩沖容量遷移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度復(fù)雜DNA混合物；超螺旋DNATBE很高較慢低分子量高價(jià)格昂貴，不常用TPE常用電泳緩沖液緩沖液緩沖容量遷移速度分辨率用途TAE最低最電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗溴化乙錠溴化乙錠（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴鹽EthidiumBromide，EB），EB染色（EB可很好地?fù)饺氲诫p鏈DNA中），在紫外光下會(huì)發(fā)出橙紅色的熒光，用于對(duì)DNA進(jìn)行染色和觀察。用于觀察的紫外光有３種波長(zhǎng)，一般使用中波紫外光（３０２ｎｍ）。短波紫外光（２５４ｎｍ）觀察效果較好，但對(duì)DNA的破環(huán)很大。長(zhǎng)波紫外光（３６６ｎｍ）：回收。溴化乙錠溴化乙錠（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dnappt課件瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dnappt課件EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡(jiǎn)便，快速，室溫下15-20min；不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以加到樣品中或膠中。EB是誘變劑，使用時(shí)一定要戴手套。EB廢液要經(jīng)過(guò)處理才能丟棄。SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價(jià)格較昂貴。EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡(jiǎn)便，快速，室溫下15-20min；不【五】實(shí)驗(yàn)步驟制備瓊脂糖凝膠（1%）制備凝膠板加樣電泳

染色結(jié)果觀察

【五】實(shí)驗(yàn)步驟制備瓊脂糖凝膠（1%）（1）制備凝膠和膠板：

45ml(1×TBE)+0.4g瓊脂糖（三角瓶

），

煮膠，溶解，冷卻至60℃(不燙手)，倒板(4-6mm)，室溫下充分凝固，豎直拔下梳子。膠板設(shè)計(jì)（44人）：每18孔膠板（5人X3樣品+1marker），8膠板每8孔膠板（2人X3樣品+1marker），2膠板（1）制備凝膠和膠板：（2

）加樣：

5μl質(zhì)粒DNA+1μlloadingbuffer

，混勻15μlPCR產(chǎn)物+3μlloadingbuffer，混勻10μl酶切產(chǎn)物+2μlloadingbuffer，混勻6μlDNAMark（每板膠加一孔）（3）電泳：電壓3-5V/cm，約80-90V，注意電極方向（4）染色：EB染