苯磺酸氨氯地平對(duì)夾雜帶絲豬抗氧化酶活性的影響

苯磺酸氨氯地平對(duì)夾雜帶絲豬抗氧化酶活性的影響

0底棲無(wú)脊腰椎生物的分布作為一種廣泛使用和潛在健康效應(yīng)的新興污染物，藥物和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品（pps）已引起人們的關(guān)注。夾雜帶絲蚓(Lumbriculusvariegatus),帶絲蚓目,帶絲蚓科(Lumbsriculidae),是一類底棲無(wú)脊椎生物,一般棲息在河流,湖泊,池塘,沼澤地、水庫(kù)沉積物上層好氧區(qū),是水生食物鏈中的重要組成部分,在我國(guó)主要分部于廣東、黑龍江、湖南、江蘇、江西、新疆、西藏等地,繁殖周期約為2~3周。根據(jù)美國(guó)EPA600/R-99/064(Methodsformeasuringthetoxicityandbioaccumulationofsediment-associatedcontaminantswithfreshwaterinvertebrates)本文以?shī)A雜帶絲蚓為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴?研究AB對(duì)夾雜帶絲蚓的急性毒性及長(zhǎng)期暴露的毒性效應(yīng),考查AB對(duì)夾雜帶絲蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD),過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響,篩選靈敏的生化指標(biāo)作為AB類PPCPs對(duì)水體污染的早期預(yù)警指標(biāo),以期為PPCPs的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供必要的生態(tài)毒理學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。1材料和方法1.1試驗(yàn)方法和設(shè)備AB(純度98%,購(gòu)自sigma-aldrich公司),以二甲亞砜(DMSO)作為助溶劑,助溶劑體積比控制為0.1%(預(yù)試驗(yàn)證實(shí)在此助溶劑濃度對(duì)毒性試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響)。試驗(yàn)中用于稀釋溶液的水均為曝氣24h以上的自來(lái)水。供試夾雜帶絲蚓自2015年從西藏林芝市野外采集,中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)室人工馴養(yǎng)繁殖,養(yǎng)殖溫度控制在20±2℃,控制光照周期:16(光照):8(黑暗),每天喂食少量粉末飼料。帶絲蚓養(yǎng)殖所用溶液用超純水根據(jù)如下比例配制:NaHCO1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1ab試驗(yàn)質(zhì)量濃度采用半靜態(tài)法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn),AB暴露液的更換頻率為24h。首先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),確定夾雜帶絲蚓全部致死的最低濃度和無(wú)毒性效應(yīng)的最高濃度,再設(shè)置AB試驗(yàn)質(zhì)量濃度為0.500,1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00,12.00mg/L8個(gè)濃度,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和助溶劑對(duì)照,每組3個(gè)平行。于250mL的燒杯中加入100mL的暴露液,各組放入經(jīng)馴養(yǎng)后個(gè)體大小一致的夾雜帶絲蚓40條,整個(gè)試驗(yàn)周期為96h,間隔12h觀察夾雜帶絲蚓的死亡狀況并做好記錄,同時(shí)處理死亡的夾雜帶絲蚓,繪制出相關(guān)性曲線。1.2.2酶活性測(cè)定及動(dòng)態(tài)試驗(yàn)靜態(tài)試驗(yàn):根據(jù)1.2.1急性毒性試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置0.025,0.100,0.500和1.00mg/L4組安全濃度進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間暴露試驗(yàn)。在500mL燒杯內(nèi)放入個(gè)體大小一致的夾雜帶絲蚓80條,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組,加入400mL試驗(yàn)濃度溶液,每隔24h更換1次,每組設(shè)3個(gè)平行。暴露1和7d后。取樣測(cè)定夾雜帶絲蚓體內(nèi)酶活性。動(dòng)態(tài)試驗(yàn):固定1.000mg/L質(zhì)量濃度,同時(shí)對(duì)照組,經(jīng)一定時(shí)間間隔取樣測(cè)定夾雜帶絲蚓體內(nèi)酶活性,暴露時(shí)間最長(zhǎng)為10d。每隔24h更換1次暴露溶液,每組設(shè)置3個(gè)平行。染毒結(jié)束后,從燒杯中取出夾雜帶絲蚓個(gè)體,用濾紙吸干個(gè)體表面水分,稱重后,按1∶10(質(zhì)量/體積)加入磷酸鹽緩沖液(pH值8.0,濃度0.1mol/L),進(jìn)行冰浴勻漿。勻漿液經(jīng)于4℃,8000r/min下離心15min。取上清液,低溫保存待檢測(cè)。1.2.3sod,cat和pod酶活性檢測(cè)蛋白檢測(cè)采用Bradford法蛋白檢測(cè)試劑盒,購(gòu)置南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的檢測(cè)試劑盒,SOD,CAT和POD酶活性均使用對(duì)應(yīng)的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),按使用說(shuō)明進(jìn)行分析檢測(cè)。1.3處理數(shù)據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS和EXCEL軟件進(jìn)行分析與處理,半致死劑量效應(yīng)濃度(LC2結(jié)果與討論2.1ab對(duì)產(chǎn)品的急性毒性試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中,空白對(duì)照的夾雜帶絲蚓沒(méi)有發(fā)生異常現(xiàn)象以及死亡,同樣DMSO助溶劑對(duì)照組也未發(fā)生上述情況,這便說(shuō)明了助溶劑DMSO不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。AB對(duì)夾雜帶絲蚓的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著暴露濃度的增加,夾雜帶絲蚓死亡率呈逐漸上升的趨勢(shì)。對(duì)96h濃度對(duì)數(shù)與概率單位的回歸方程、LC2.2ab對(duì)殘余帶絲砂體sod活性的影響AB暴露對(duì)SOD活性的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知,無(wú)論是暴露1d還是7d,隨著暴露濃度的增大,SOD活性均表現(xiàn)為先升高后降低,呈倒U型變化。與對(duì)照組相比,0.025mg/L低質(zhì)量濃度暴露即可對(duì)SOD產(chǎn)生極顯著誘導(dǎo)(P<0.01),當(dāng)AB暴露質(zhì)量濃度為0.100mg/L時(shí),SOD活性達(dá)到最大值,其活性分別為對(duì)照組的1.53和1.87倍。當(dāng)AB暴露質(zhì)量濃度大于0.100mg/L后,SOD活性出現(xiàn)下降,然而經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),各濃度組的SOD活性仍比對(duì)照組的活性高。SOD酶作為生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑,在AB暴露濃度較低時(shí),由于受到氧化脅迫,夾雜帶絲蚓體內(nèi)SOD酶被誘導(dǎo)而活性升高,而當(dāng)AB濃度增大或暴露時(shí)間延長(zhǎng)時(shí),過(guò)量的AB氧化脅迫可迫使夾雜帶絲蚓機(jī)體產(chǎn)生活性氧的量增大,SOD的活性隨之被誘導(dǎo)并逐漸升高。但過(guò)高的濃度會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)活性氧自由基含量的增長(zhǎng)要高于SOD酶的誘導(dǎo)能力,這種歧化能力超出正常水平現(xiàn)象的出現(xiàn),會(huì)使得整個(gè)的細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到破壞并且生理代謝功能發(fā)生紊亂,最終會(huì)抑制SOD的活性從而表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)2.3cat的活性AB暴露對(duì)CAT活性的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知,暴露1d后,各濃度組CAT活性顯著被誘導(dǎo)(P<0.05),與暴露1d相比,暴露7d后,CAT活性顯著下降(P<0.05),呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的效應(yīng)。暴露1d后,CAT活性在質(zhì)量濃度為0.025mg/L時(shí)就可被誘導(dǎo),當(dāng)AB質(zhì)量濃度為0.100mg/L時(shí)達(dá)最大,為對(duì)照組的1.75倍。質(zhì)量濃度>0.100mg/L時(shí)活性有所下降。文獻(xiàn)報(bào)道,CAT作為雙氧水濃度的調(diào)節(jié)器,在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)的協(xié)同作用下,可與POD酶一起通過(guò)將SOD酶歧化超氧陰離子自由基的雙氧水產(chǎn)物轉(zhuǎn)換為水和氧的方式來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)雙氧水的濃度,進(jìn)而將機(jī)體受到污染物的毒害減輕2.4ab暴露對(duì)pod活性的影響AB暴露對(duì)POD活性的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知,無(wú)論是暴露1d還是7d,0.025mg/L低濃度質(zhì)量組POD活性被最大誘導(dǎo),與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01),暴露1d的數(shù)據(jù)是對(duì)照組的1.33倍,暴露7d的數(shù)據(jù)則是對(duì)照組的1.43倍。POD的活性在暴露濃度不斷增大的情況下呈現(xiàn)出逐步下降的趨勢(shì),當(dāng)AB暴露質(zhì)量濃度增大至1.000mg/L時(shí),POD活性降至最低,與對(duì)照組相比表現(xiàn)為顯著抑制。該結(jié)果與陳雨萌等2.5ab暴露時(shí)間對(duì)cat活性的影響夾雜帶絲蚓體內(nèi)酶活性隨暴露時(shí)間的變化見(jiàn)圖4。由圖4可知,開(kāi)始暴露時(shí)夾雜帶絲蚓體內(nèi)SOD酶活性先快速升高,3d后達(dá)到最大值,增長(zhǎng)率約為40%。隨著AB暴露時(shí)間的延長(zhǎng),SOD酶活性逐步受到抑制,到第7天后接近空白對(duì)照的水平,隨后基本不變。CAT酶活性也是隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng),開(kāi)始快速上長(zhǎng)升,到第5天時(shí)CAT活性達(dá)到最大,此時(shí)CAT活性大約為暴露前的1.77倍,隨后開(kāi)始快速下降,到第10天時(shí),CAT活性約為暴露前的67%。POD的活性在AB暴露時(shí)間為1d時(shí)便明顯降低,當(dāng)暴露到第3天時(shí)它的活性又升高到最高,之后隨著AB暴露時(shí)間的延長(zhǎng),POD活性再次受到抑制,到第10天時(shí),與暴露前相比表現(xiàn)為極顯著抑制(P<0.01),抑制率約為37%。由圖1~圖4可見(jiàn),CAT活性隨暴露濃度和暴露時(shí)間的變化與SOD和POD相比更大,相對(duì)來(lái)說(shuō)更加靈敏。3氨氯地平對(duì)殘余帶絲砂抗氧化酶活性的影響近年來(lái),有關(guān)PPCPs在水環(huán)境中的分布及對(duì)人類與動(dòng)植物的健康風(fēng)險(xiǎn)的研究,越來(lái)越受到環(huán)境科技工作者的關(guān)注。但作為一類廣泛應(yīng)用的治療高血壓藥物,氨氯地平在環(huán)境中的分布及對(duì)野生動(dòng)物的毒性效應(yīng),還鮮有報(bào)道。ASHFAQ等(