CRISPR–Cas系統(tǒng),基因組改造新技術(shù)

CRISPR-Cas系統(tǒng)，基因組改造新技術(shù)有一種細菌編碼的酶能夠利用向?qū)NA(guideRNA)分子對特定的DNA片段進行定向切割，科學(xué)家們利用這種特點開發(fā)出了一種能夠?qū)蚪M進行特異性定點改造的工具，對細胞乃至整個生物體進行基因組改造。目前已經(jīng)利用這種技術(shù)對細菌、人體細胞以及斑馬魚進行過成功的遺傳學(xué)改造工作。日本大阪大學(xué)(OsakaUniversity)的科研人員們曾經(jīng)在1987年發(fā)表過一篇論文，不過這篇論文在當(dāng)時并沒有引起太多人的注意，只不過是一篇普普通通的小文章。這幫大阪大學(xué)的科學(xué)家當(dāng)時正在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)基因進行研究，不過他們在工作中發(fā)現(xiàn)，在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。關(guān)于這樣一個重復(fù)序列他們當(dāng)時在論文中是這樣評價白一“我們目前也不太清楚這些序列的生物學(xué)意義?！辈贿^這個在差不多三十年之前取得的不起眼的“小發(fā)現(xiàn)”在今天卻綻放出了耀眼的光芒，因為如今科學(xué)家們正是利用這個小片段找到了一種可以對多種生物的基因組進行遺傳改造的工具，而且這種方法操作起來還非常地簡單。就在短短的一個月之內(nèi)，在包括《科學(xué)》(Scienee)和《自然生物技術(shù)》(NatureBiotechnology)等雜志上就已經(jīng)發(fā)表了5篇相關(guān)的論文介紹這個現(xiàn)在被稱作CRISPR-Cas系統(tǒng)(CRISPR-Cassystems)、簡便而又實用的基因組改造新技術(shù)。近幾十年來，隨著全基因組測序技術(shù)的不斷成熟，我們在各種細菌和古細菌(archaea)中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences,即CRISPR序列，這就是二十多年前日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的那個序列)和CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associatedgenes,Casgene)。研究發(fā)現(xiàn)，這些CRISPR序列與很多病毒或者質(zhì)粒的DNA序列是互補的，說明這套CRISPR-Cas系統(tǒng)很有可能是生物體抵御病毒等外來入侵者的一套特異性防御機制，就好像是另外一套適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)(adaptiveimmunesystem)。后續(xù)的遺傳學(xué)試驗和生物化學(xué)試驗也證實了這種猜測。雖然有很多CRISPR-Cas系統(tǒng)需要多種蛋白的參與，但是在很多細菌的胞內(nèi)都只需要一種內(nèi)切酶(endonuclease)Cas9就足夠了，我們將這種CRISPR-Cas系統(tǒng)也稱作2型系統(tǒng)(typeIIsystems)，如圖1所示。Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA的指引下能夠?qū)Ω鞣N入侵的外源DNA分子進行定點切割，不過主要識別的還是保守的間隔相鄰基序(proto-spaceradjacentmotifs，PAM基序)。如果要形成一個有功能的DNA切割復(fù)合體，還需要另外兩個RNA分子的幫助，它們就是CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA(trans-actingCRISPRRNA,tracrRNA)。不過最近有研究發(fā)現(xiàn)，這兩種RNA可以被“改裝”成一個向?qū)NA(single-guideRNA,sgRNA)。這個sgRNA足以幫助Cas9內(nèi)切酶對DNA進行定點切割。最新的報道稱，在多種類型的細胞和生物體內(nèi)，這種RNA介導(dǎo)的Cas9酶切作

用能夠正常地行使功能，在完整基因組上的特定位點完成切割反應(yīng)。這樣就可以方便地進行后續(xù)的基因組改造工作了。細胞通常會通過兩種方式對發(fā)生雙鏈斷裂的DNA進行修復(fù)，這兩種方式分別是同源重組修復(fù)機制(homologousrecombination,HR)和非同源末端連接修復(fù)機制(non-homologousendjoining,NHEJ)，不過在修復(fù)的過程中細胞有可能會對修復(fù)位點進行修飾，或者插入新的遺傳信息。M3^ttDNA#r裂修童Q內(nèi)切酶M3^ttDNA#r裂修童Q內(nèi)切酶與基固組序列匹配基因iflDNAIIIIVEIirET■tlIIIIVEIirET■tlji人悴朗胞已/細菌細胞人悴朗胞已/細菌細胞圖1RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)定向基因組修飾作用機制示意圖。Cas9內(nèi)切酶是一種DNA內(nèi)切酶，很多細菌都可以表達這種蛋白，Cas9內(nèi)切酶能夠為細菌提供一種防御機制，避免病毒或者質(zhì)粒等外源DNA的侵入。Cas9內(nèi)切酶必須在向?qū)NA分子的引導(dǎo)下對DNA進行切割，這是因為這些向?qū)NA分子含有與靶DNA序列互補的序列，我們稱之為PAM序列。Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA分子的引導(dǎo)下對特定位點的DNA進行切割，形成雙鏈DNA缺口，然后細胞會借助同源重組機制(homologousrecombination)或者非同源末端連接機制(non-homologousendjoining)對斷裂的DNA進行修復(fù)。如果細胞通過同源重組機制進行

修復(fù)，會用另外一段DNA片段填補斷裂的DNA缺口，因而會引入一段，新的”遺傳信息。

最近有多項研究都表明，RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)可以被用于對人類和小鼠細胞，以及細菌或

斑馬魚胚胎進行基因組改造的工作當(dāng)中。

Cong、Mali和Cho這三個課題組開展的多項研究都表明這種RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)在人類細胞當(dāng)中同樣能夠正常的發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，對化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)編碼的Cas9內(nèi)切酶進行改造之后也可以讓它們在人類細胞的細胞核中被活化，然后再搭配針對人體DNA序列設(shè)計的大約20bp長的雙RNA復(fù)合體或者sgRNA，就可以對人體基因組進行定點切割和改造。科研人員們在多種人體細胞(其中還包括了誘導(dǎo)多能干細胞)內(nèi)共表達了這種專用于人體的Cas9內(nèi)切酶和向?qū)NA，結(jié)果都在預(yù)定的DNA位點觀察到了基因組雙鏈DNA切割，以及后續(xù)的修復(fù)現(xiàn)象，成功率高達38%,而且還發(fā)現(xiàn)這種Cas9內(nèi)切酶對細胞幾乎沒有毒性。這套Cas9系統(tǒng)還能夠在人體細胞內(nèi)以非常高的效率對普通的基因組位點進行定向基因替換(targetedgenereplacement)的操作。在Jinek等人于同期發(fā)表的另外一篇論文中，他們發(fā)現(xiàn)這套RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)還能夠在人體細胞內(nèi)誘發(fā)位點特異性的基因組修飾動作(site-specificgenomemodifications),而且他們還發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合、組裝的動作是這套位點特異性的基因組修飾過程里的限速步驟。之前的研究發(fā)現(xiàn)，細胞更傾向于使用同源重組機制對單鏈DNA損傷(single-strandedDNAbreaks)進行修復(fù)，因此引入的突變也會更少，Mali和Cong等人也對各種不同的、只能夠形成單鏈DNA斷裂的Cas9內(nèi)切酶進行了試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些突變的Cas9內(nèi)切酶在細胞內(nèi)引發(fā)NHEJ修復(fù)的機率的確更低，但是它們在引發(fā)基因替換(這主要是借助同源重組修復(fù)機制)的效率方面與野生型的Cas9內(nèi)切酶不相上下。Mali和Cong這兩個課題組還發(fā)現(xiàn)這套Cas9系統(tǒng)具有多重靶向功能(multiplexedtargeting)，這些Cas9內(nèi)切酶能夠與基因組中兩個不同的序列(位點)結(jié)合，形成多處斷裂。此外，Cong等人還發(fā)現(xiàn)如果分別表達tracrRNA和crRNA，還可以進一步提高切割的效率。這一發(fā)現(xiàn)表明，如果進一步改進sgRNA的設(shè)計方案，使其更接近雙RNA復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，將會進一步提高Cas9系統(tǒng)的基因組編輯效率。除了這些細胞學(xué)的研究成果之外，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)這套Cas9系統(tǒng)對于生物體同樣有效，一樣可以對生物體進行基因組改造的操作。Jiang等人發(fā)現(xiàn)，在細菌內(nèi)表達多種向?qū)NA之后，Cas9內(nèi)切酶可以對細菌基因組的多個位點進行修飾操作。借助這一技術(shù)可以對各種微生物進行遺傳學(xué)改造，打造出符合我們?nèi)祟愋枰墓こ涛⑸?，使其造福人類，在生物能源或者生物制藥等諸多領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。Hwang等人則使用單細胞斑馬魚胚胎(one-cell-stageembryos)進行了試驗，他們將編碼Cas9蛋白的mRNA和特定的向?qū)NA(與斑馬魚基因組DNA的匹配機率高達24~59%)注射到斑馬魚胚胎內(nèi)，結(jié)果取得了成功，在所有被注射的斑馬魚胚胎內(nèi)，10個切割位點中有8個位點都發(fā)生了切割，并且引入了插入或者缺失突變。這一試驗結(jié)果表明，RNA介導(dǎo)的Cas9切割活性完全可以應(yīng)用于生物體水平，哺乳動物和植物都可以使用這種技術(shù)進行遺傳學(xué)改造。目前最有價值的應(yīng)用應(yīng)該就是使用這種技術(shù)為各種人類疾病構(gòu)建出動物模型。這種基因組改造技術(shù)還可以被應(yīng)用于合成生物學(xué)(syntheticbiology)、基因定向干擾或者多重基因干擾(即基因網(wǎng)絡(luò)干擾)和基因治療等領(lǐng)域。接下來的研究難點應(yīng)該就是如何克服脫靶效應(yīng)(off-targeteffect)，如何提高基因組改造的效率和特異性，以及如何將這項技術(shù)應(yīng)用于更多的物種等方面。所以我們也需要對這種Cas9平臺與其它的基因組改造技術(shù)，比如巨核酶技術(shù)(meganucleases)、鋅指核酶技術(shù)(zinc-fingernucleases)以及TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)技術(shù)等進行深入和全面的對比。除了在基因組改造方面的應(yīng)用之外，使用Cas9平臺還可以進行基因沉默等方面的