中藥生產(chǎn)中的十八亞慢性毒性試驗研究

中藥生產(chǎn)中的十八亞慢性毒性試驗研究

黨參，名：codolosula（franch.）nanf。桔梗科黨參屬,多年生草本植物,有乳汁;莖基具多數(shù)瘤狀莖痕,根常肥大呈紡錘狀或紡錘狀圓柱形,較少分枝或中部以下略有分枝,表面灰黃色,上端5cm~10cm部分有細(xì)密環(huán)紋;生于海拔1560m~3100m的山地林邊及灌叢中,中國各地有大量栽培黨參為常用大宗藥材,其性味甘平、無毒,有補(bǔ)中益氣、生津止渴等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實,黨參對心血管系統(tǒng)、血液及造血功能、消化系統(tǒng)、機(jī)體免疫功能、延緩衰老、抗疲勞、抑制癌細(xì)胞等均可起到相應(yīng)的藥理作用1材料和方法1.1材料表面1.1.1種子提取黨參由山西振東制藥股份有限公司提供,黨參原料呈長圓柱形,表面灰黃色、黃棕色至灰棕色。實驗前取黨參原料按照料液比為1∶8的比例,加水浸泡30min,在微沸狀態(tài)下提取2次,合并提取液,過濾;濾過的殘渣用75%的乙醇,按照料液比為1∶10的比例,回流提取2次,合并提取液,過濾。將水提和醇提的濾液合并,在70℃~75℃、-0.07Mpa~-0.08Mpa的條件下進(jìn)行濃縮,對濃縮液進(jìn)行微波干燥、粉碎后,制成提取物粉待用,1g提取物粉相當(dāng)于2g原料。1.1.2實驗動物與體質(zhì)量試驗用ICR小鼠由浙江省實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2014-0001,實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2014-0008。體質(zhì)量為18g~22g,雌雄各半,用于急性經(jīng)口毒性試驗;體質(zhì)量為25g~30g,雌雄各半,用于遺傳毒性試驗。飼養(yǎng)溫度為20℃~25℃,飼養(yǎng)濕度為40%~70%1.1.3蘑菇細(xì)菌回復(fù)突變試驗選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌,共4株,即TA1.2深圳藍(lán)韻服務(wù)業(yè)有限公司TEK8530全自動五分類血液分析儀(江西特康科技有限公司);XL1800血凝儀(上海迅達(dá)醫(yī)學(xué)科技有限公司);藍(lán)韻LWC400全自動生化分析儀(深圳藍(lán)韻實業(yè)有限公司);XD685電解質(zhì)分析儀(杭州眾馳科技有限公司);尿液分析儀(桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司);YZ11D檢眼鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)。2-乙酰氨基芴(批號:STBF2-332V);1,8-二羥基蒽醌(批號:WXBC4791V);疊氮鈉(批號:81G10150);敵克松(批號:285-75B);絲裂霉素C(批號:M0308A);環(huán)磷酰胺(批號:MKBS0-021V);秋水仙素(批號:J1210A)。1.3方法1.3.1急性口腔毒性試驗1.3.1.灌胃二次新鮮度20%選用健康、成熟ICR小鼠20只,雌雄各半,按限量法設(shè)提取物20.0g/kgBW一個劑量組。稱取提取物20g,以1%羧甲基纖維素鈉為溶媒配制成40ml樣品液。小鼠灌胃前禁食(不禁水)6h,按20ml/kgBW灌胃容量灌胃二次,間隔4h。末次灌胃2h后動物自由進(jìn)食、飲水。1.3.1.灌胃前后大鼠不良反應(yīng)比較選用健康、成熟SD大鼠20只,雌雄各半,按限量法設(shè)提取物20.0g/kgBW一個劑量組。稱取提取物300g,以1%羧甲基纖維素鈉為溶媒配制成450ml樣品液。大鼠灌胃前禁食(不禁水)6h,按10ml/kgBW灌胃容量灌胃3次,間隔4h。末次灌胃3h后動物自由進(jìn)食、飲水。1.3.2細(xì)菌回復(fù)突變試驗試驗采用平板摻入法,選擇試驗濃度為8μg/皿、40μg/皿、200μg/皿、1000μg/皿、5000μg/皿5個劑量組。1.3.3小鼠提取物制備試驗小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,雌雄各半,分別設(shè)為陰性對照組(1%羧甲基纖維素鈉)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺)、2.5g/kg、5.0g/kg、10.0g/kg劑量組。按20ml/kgBW灌胃量經(jīng)口灌胃給予小鼠提取物,灌胃2次,間隔24h。第2次灌胃后6h處死動物,取胸骨骨髓制片,干燥固定,Giemsa染色。1.3.4秋水仙素酯類化合物環(huán)磷酰胺鹽酰胺2次注射小鼠隨機(jī)分為5組,每組5只。設(shè)2.5g/kg、5.0g/kg、10.0g/kg3個劑量組。另設(shè)一個陰性對照組(1%羧甲基纖維素鈉)和一個陽性對照組(環(huán)磷酰胺40mg/kgBW,稱取環(huán)磷酰胺80mg,加生理鹽水溶解至40ml,單次腹腔注射)。各劑量組小鼠按20ml/kgBW灌胃容量經(jīng)口灌胃給予提取物,連續(xù)5d,1d1次。各組均于第一次給予提取物后的第13d將小鼠處死采樣。小鼠處死前5h腹腔注射秋水仙素6mg/kgBW。用頸椎脫臼法處死小鼠,取2側(cè)睪丸,低滲處理,分離曲細(xì)精管,吹打靜置,以固定液固定2次,常規(guī)離心,去上清液后于低溫環(huán)境下滴片,自然干燥,Giemsa染色。1.3.5動物剖檢指標(biāo)試驗用SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后,按體質(zhì)量隨機(jī)分組,每組20只,雌雄各半,設(shè)1個陰性對照組(基礎(chǔ)飼料)和3個提取物劑量組:2.0g/kgBW、4.0g/kgBW、8.0g/kgBW(相當(dāng)于黨參4.0g/kgBW、8.0g/kgBW、16.0g/kgBW);在陰性對照組和高劑量組添加衛(wèi)星組。將提取物按體質(zhì)量8%折算摻入飼料中喂養(yǎng),大鼠自由進(jìn)食、飲水,連續(xù)觀察13周,每周記錄體質(zhì)量和進(jìn)食量并計算食物利用率,試驗中期對衛(wèi)星組大鼠進(jìn)行尿常規(guī)檢測,禁食過夜,腹主動脈采血測定血常規(guī)及血生化指標(biāo);試驗?zāi)┢谒写笫筮M(jìn)行尿常規(guī)檢測,禁食過夜,腹主動脈采血測定血生化及血常規(guī)指標(biāo),解剖動物觀察各臟器大體改變,摘取腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、睪丸/卵巢、附睪/子宮、腎上腺、胸腺測定濕重,計算臟體比;取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、垂體、甲狀腺、胸腺、胃、十二指腸、胰臟、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、淋巴結(jié)、腎上腺、前列腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮進(jìn)行病理組織學(xué)觀察,臟器石蠟切片,蘇木素-伊紅(HE)染色。1.4統(tǒng)計處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料采用配對t檢驗,計數(shù)資料采用χ2結(jié)果2.1急性口腔毒性試驗以20g/kgBW劑量的提取物對大小鼠進(jìn)行試驗后未見明顯中毒癥狀。黨參提取物對雌雄大小鼠的經(jīng)口LD2.2回復(fù)突變試驗對TA97、TA98、TA100、TA1024株試驗菌株,不同濃度提取物在加和不加S9條件下的回變菌落數(shù)與陰性對照組近似,而陽性對照組回變菌落數(shù)均高于陰性對照組回變菌落數(shù)2倍以上。黨參提取物細(xì)菌回復(fù)突變試驗檢測結(jié)果為陰性,重復(fù)試驗仍得出相同結(jié)果。2.3各組大鼠血清中血清型馬來安氏氏菌性別的比較黨參提取物哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗陽性對照組微核發(fā)生率(雄性2.12%,雌性2.08%)明顯高于陰性對照組(雄性0.22%,雌性0.22%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而各劑量組(雄性0.27%~0.30%,雌性0.27%~0.29%)與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組PCE/RBC比值均在正常范圍內(nèi),表明黨參提取物對哺乳動物紅細(xì)胞微核未見明顯影響,檢測結(jié)果為陰性。2.4不同統(tǒng)計學(xué)意義的比較黨參提取物各劑量組染色體異常細(xì)胞率(0.4%~0.6%)與陰性對照組(0.8%)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而陽性對照組染色體異常細(xì)胞率(9.2%)明顯高于陰性對照組染色體異常細(xì)胞率(0.8%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明黨參提取物對小鼠精母細(xì)胞染色體畸變發(fā)生率未見明顯影響,檢測結(jié)果為陰性。2.590d口腔毒性試驗2.5.1一般觀察2.5.2黨參對大鼠體重增加、總食入量和總食物利用率的影響在整個試驗期,提取物各劑量組雌、雄大鼠的增重及食物利用率與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。2.5.3正常范圍及血常規(guī)及血生化指標(biāo)雄性高劑量組大鼠ALT指標(biāo)明顯低于陰性對照組(P<0.05),其余各劑量組的雌雄大鼠在試驗中所測得的血常規(guī)指標(biāo)及血生化指標(biāo)均在正常范圍(表2、表3)。2.5.4對大鼠臟器組織病理學(xué)改變的影響各劑量組雌性和雄性試驗大鼠的臟器重量與陰性對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表4)。病理切片顯微鏡檢發(fā)現(xiàn):陰性對照組2只雄鼠可見輕度胰腺腺泡間脂肪細(xì)胞浸潤;高劑量組均有1只雄鼠可見匯管區(qū)輕度淋巴細(xì)胞浸潤;陰性對照組3只雄鼠、3只雌鼠,高劑量組4只雄鼠、3只雌鼠可見輕度肺泡間隔變寬;陰性對照組1只雄鼠可見輕度間質(zhì)性肺炎;高劑量組1只雄鼠、1只雌鼠可見輕度肺泡脂質(zhì)沉積;陰性對照組8只雄鼠、10只雌鼠,高劑量組8只雄鼠、7只雌鼠可見輕度腎小管擴(kuò)張;陰性對照組2只雄鼠可見輕度腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤;陰性對照組1只雄鼠可見輕度腎小管再生;陰性對照組1只雄鼠可見輕度附睪炎;陰性對照組3只雄鼠,高劑量組2只雄鼠可見輕度前列腺炎。高劑量組雌、雄大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、垂體、甲狀腺、胸腺、胃、十二指腸、胰臟、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、淋巴結(jié)、腎上腺、前列腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮均未見明顯與試驗因素有關(guān)的病理組織學(xué)變化。黨參提取物對試驗大鼠大體解剖、組織學(xué)觀察未見明顯影響。3對野生參保動物的安全性評價黨參在我國的種植歷史悠久,是常用的傳統(tǒng)補(bǔ)益藥,古代以山西上黨地區(qū)出產(chǎn)的黨參為上品,目前市場上的黨參主產(chǎn)于山西、甘肅、陜西、四川、湖北等省,主要為栽培品,少量為野生黨參中包含甾醇類、多糖、生物堿、揮發(fā)油、三萜